[发明专利]一种甘蔗分子标记PAGE凝胶超快速银染检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种甘蔗分子标记PAGE凝胶的超快速银染检测方法。

背景技术：

甘蔗的分子标记技术近年来得到快速发展，目前针对甘蔗种质资源研究最有效的分子标记技术为AFLP和SSR标记，对两种标记的扩增片段多用聚丙烯酰胺凝胶，凝胶的显影有两种方式：银染显影和放射性显影，放射性显影虽能较清晰的显示扩增片段，但由于其实验成本过高及对从业人员身体危害比较大，因此较少采用；银染方法通过甲醛将银离子还原出来，银离子与核酸结合从而显出扩增带，达到显影的目的，其分辨率能够满足检测要求。

目前，所报道的银染方法多为常规银染方法和经过改良的方法，但依然存在步骤多，所用试剂强碱强酸有毒，不仅耗时耗力，对人体也有一定的伤害，而且显影的质量也有好有坏。

发明内容：

本发明的目的是提出一种甘蔗分子标记PAGE凝胶的超快速银染检测方法，该方法能有效提高银染的速度，同时减少一些有害试剂的使用。

本发明的目的通过以下步骤实现：

1、用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR标记和AFLP标记的PCR扩增物。

2、将电泳好的凝胶放入染色液染色。

3、将凝胶从染色液中取出，快速冲洗，放入显影液里显影。

4、显影好的凝胶用蒸馏水清洗两次，晾干读带。

本发明将传统的固定、染色、显影和定影四个步骤合成两个最简单的步骤，同时减少了洗涤次数和时间，减少了固定液、定影液及乙酸、无水乙醇、碳酸钠、硫代硫酸钠的使用，不仅大大减少了银染时间、试剂成本，同时也保证了高质量的银染效果，相比较其他传统或改良银染和同位素方法具有较大的时间成本优势。整个过程只需要10分钟时间，在保证快速少害的同时，又能进一步提高银染显影质量，提高分子标记扩增带的检出率。

具体实施方式：

本发明的方法步骤是：

a、用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR标记和AFLP标记的PCR扩增物。

1、采用常规SSR标记和AFLP标记方法对甘蔗基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

2、取3.8ul产物进行凝胶电泳检测。

b、将电泳好的凝胶放入染色液染色。

1、染色液的配置：称2g硝酸银加入2L去离子水中配成0.1％的染色液；

2、将电泳好的凝胶放入染色液中染色5分钟。

c、将凝胶从染色液中取出，快速冲洗，放入显影液里显影。

1、显影液的配置：30gNaOH，15ml 37％甲醛加入到2L去离子水中；

2、将染色好的凝胶用去离子水清洗5秒，放入显影液里显影4分钟左右。

D、显影好的凝胶用蒸馏水清洗两次，晾干读带。

1、显影完全后用清水清洗两次，晾干；

2、胶片晾干后即可读带。