[发明专利]一种通过花药培养获得马蹄莲单培体植株的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种通过花药培养获得马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)单倍体植株的方法，属花卉育种技术领域。

背景技术：

马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)为天南星科(Araceae)马蹄莲属(Zantedeschia)多年生球根花卉，是优良的鲜切花和盆栽花卉；马蹄莲的传统品种开白花，但目前市场上该种中也有开其它艳丽色彩花的品种，高洁皓白或色彩艳丽、形态高雅的马蹄莲在花卉市场上占有重要的地位。

现有技术中，采用系谱法获得马蹄莲遗传稳定纯系，该方法获得马蹄莲遗传稳定纯系需6-7代(15-20年)。该方法不仅时间长，而且成本高。

马蹄莲单倍体植株在遗传育种研究中具有重要应用价值，单倍体植株经染色体加倍，只需要一个世代(2-3年)就获得遗传上稳定的纯系，为F1杂交一代新品种培育提供亲本材料，以及为园艺性状遗传规律研究提供纯系，与常规系谱法获得遗传稳定纯系需6-7代(15-20年)时间相比，通过产生单倍体植株而获得纯系是加速育种材料的纯化与育种进程的一条途径。另一方面，马蹄莲单倍体植株是基因工程中遗传转化的理想受体材料，也是无性系突变体筛选的理想材料，目的基因转化的单倍体，以及产生突变的单倍体，经染色体加倍后，基因型得以纯合，避免了后代群体中目的基因或突变基因的分离。由于基因重组，马蹄莲杂交品种的小孢子群体中出现不同基因型个体，因此对花药内小孢子进行再生培养，是获得不同与母体品种的新种质的一条有效途径。

经文献检索，未见与本发明技术内容相同的公开报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种获得马蹄莲单倍体植株的方法，即通过对马蹄莲花药进行离体培养，花药内小孢子发育为单倍体植株。

本发明方法的具体步骤如下：

a.供体马蹄莲材料的适宜生长季节为秋、冬季节，适宜生长温度为最高气温25℃，最低气温10℃；

b.进行离体培养的花药及小孢子的合适发育时期：花蕾微露出叶柄、花药颜色呈乳白色、小孢子处在单核靠边期；

c.外植体消毒：取小孢子处在单核靠边期的马蹄莲花蕾，剥去苞片，在超净工作台中，用1％次氯酸钠+0.05％Tween-20消毒花蕊，时间为10分钟，然后用无菌水冲洗3次，冲洗时间分别为1分钟，5分钟，10分钟；

d.愈伤组织的诱导：用解剖刀将经上述消毒的花药从花蕊上刮下，接种在愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基配方为Gamborg B5(B5)+蔗糖80g/L+KT 1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L+琼脂7g/L，培养基用母液配置，用1mol/LNaOH调pH到5.8，121℃15分钟高压灭菌，其中激素是过滤灭菌，在培养基分装前加入，高压灭菌后的培养基冷却到40℃时在超净工作台内快速分装在已高压灭菌的60x15mm的培养皿中，每皿装10mL愈伤组织诱导培养基，接种密度为60-70个花药/培养皿，培养条件为32℃、暗培养2天后，转入25℃、暗培养50天，再将其转至上述愈伤组织诱导培养基，在25℃、黑暗条件下，进行继代培养20天，花药长出愈伤组织；

e.愈伤组织分化芽：将上述继代培养20天后的愈伤组织置于芽诱导培养基，诱导生芽，芽诱导培养基配方为Murashige and Skoog(MS)+蔗糖30g/L+BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7g/L，pH5.8，培养条件：温度25℃，光强2000Lx，光照时间16小时，培养30天后愈伤组织分化出芽；

f.芽生根：芽长到高4cm时，将芽置于生根培养基诱导生根，生根培养基配方为MS+蔗糖30g/L+IBA 0.5mg/L+琼脂7g/L，pH到5.8，在温度25℃，光强2000Lx，光照时间16小时的培养条件培养20天，小苗生根，形成马蹄莲单倍体植株。

本发明对马蹄莲花药进行离体培养，花药内小孢子发育为单倍体植株，单倍体植株经染色体加倍，只需要一个世代(2-3年)就获得遗传上稳定的纯系，与常规系谱法获得遗传稳定纯系需6-7代(15-20年)时间相比，通过产生单倍体植株而获得纯系是有效加速育种材料的纯化与育种进程的一条途径。

具体实施方式：

1、供体马蹄莲材料的合适生长条件。

供体马蹄莲材料的适宜生长季节为秋、冬季节，适宜生长温度为最高气温25℃，最低气温10℃。如昆明地区露地栽培马蹄莲的合适季节为秋季(9月-11月)。

2、离体培养的花药及小孢子的合适发育时期。