[发明专利]甘蔗宿根矮化病菌的检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种快速、准确、操作简单的甘蔗宿根矮化病菌检测方法，属植物保护领域。

背景技术：

甘蔗宿根矮化病RSD是普遍存在于所有植蔗地区的一种世界性的重要病害。自1944～1945年在澳大利亚昆士兰首次发现以来，已有美国、南非、毛里求斯、印度、巴西等47个国家和地区报道了该病的发生，遍布世界各蔗区。我国台湾省于1945年最先报道此病的发生，在大陆1986确诊存在甘蔗宿根矮化病，之后广东、福建、广西、云南曾对全省蔗区进行普查，结果表明均存在此病。此病由一种棒杆菌属细菌寄生于蔗株的维管束中引起，主要通过带病蔗种和收获、砍种刀具等传播蔓延，且传播性极强。蔗株染病后变矮，蔗茎变细，生长迟滞，宿根发株少，在干旱地区和种植感病品种的蔗区所造成的损失尤其重要，病害造成损失的程度随宿根年数的增加而增加，一般减产10～30％，干旱缺水时可达60％以上，还可导致品种退化。RSD无明显的外部和内部症状，病原菌难以分离和培养，传统诊断方法极其困难，因而迫切需要建立一种简便、快速、准确、实用的检测方法，以期为该病害的诊断和防治、脱毒种苗的生产、对外甘蔗品种/材料交换检疫检测提供技术支撑。

目前，对甘蔗宿根矮化病菌的检测方法主要有剖茎检测法、相差显微镜检测法和PCR法。但剖茎检测法和相差显微镜检测法准确性差、操作繁琐、检测灵敏低，PCR法检测体系不易稳定，因此不适合田间大批量样品的快速检测。

发明内容：

本发明的目的是提出一种甘蔗宿根矮化病菌的检测方法，该方法克服了现有检测方法中的不足，简便、快速、准确、操作简单、适合田间大批量样品检测。

本发明包括以下步骤：

1、将待测样品印在硝酸纤维素膜上获得印迹斑；

2、把硝酸纤维素膜转移至含0.1％甘蔗宿根矮化病菌特异性抗血清的封闭缓冲液中孵育；

3、把硝酸纤维素膜转移至含0.01％碱性磷酸酶标记抗体、1％脱脂奶粉的TBST缓冲液中孵育；

4、把硝酸纤维素膜转入底物/缓冲液中显色；

5、结果判别：硝酸纤维素膜显色后组织斑上呈紫红色即可确定检测样品中有甘蔗宿根矮化病菌存在，组织斑不显色则检测样品中没有甘蔗宿根矮化病菌。

本发明的有益效果是能快速准确的检测甘蔗宿根矮化病菌，检测结果易于目测判断，且操作简单，取样少，节省劳力，结果可靠，不易受污染，不需特殊仪器，也不需特殊条件，适合于田间大批量样品检测。

具体实施方式

1、制样和组织印迹：取待测甘蔗样品中下部茎节，用砍刀切成9～11cm长，用转子钻出中间部分后再用锋利刀片将其横切成平面，用力将横切面在硝酸纤维素膜上垂直点压10～15秒，获得印迹斑；

2、封闭：将封闭缓冲液倒入装有硝酸纤维素膜的培养皿里，37℃下孵育45min；

3、TBST缓冲液快速洗膜1次：倒去培养皿里封闭缓冲液，加入TBST缓冲液，使硝酸纤维素膜浸入其中，轻轻转动几下，再弃去TBST缓冲液。

4、加抗体：把硝酸纤维素膜浸入含0.1％甘蔗宿根矮化病菌特异性抗血清和1％脱脂奶粉的TBST缓冲液中，37℃下孵育2h，TBST缓冲液洗膜3次，每次3min；

5、加酶标抗体：把硝酸纤维素膜浸入含0.01％碱性磷酸酶标记抗体和1％脱脂奶粉的TBST缓冲液中，37℃下孵育2h，TBST缓冲液洗膜4次，每次3min；

6、加底物显色：把硝酸纤维素膜转入底物/缓冲液BCIP/NBT二片加20ml双蒸水溶解中显色5～10min，取出后用蒸馏水冲洗，自然干燥；

7、结果判别：肉眼观察或显微镜观察判别，感染甘蔗宿根矮化病菌的样品组织斑上呈紫红色，不感染的组织斑上不显色。

上述的TBST缓冲液由PH8.0的Tris-HCl6.05g+NaCl 2.92g+1000ml双蒸水，再按重量计加入0.5mlTween20组成。

封闭缓冲液为TBST中按重量计加入5％脱脂奶粉。

所用的酶标抗体为羊抗兔碱性磷酸酶标记抗体Goat Anti Robbit。

所用的底物BCIP/NBT是5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮蓝四唑。