[发明专利]一种药用金线莲组织培养一步成苗快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种药用金线莲组织培养一步成苗快速繁殖方法，主要用于药用金线莲的组织培养。

背景技术

金线莲[Anoectochilus roxburghii(wall.)lindl]为兰科开唇兰属多年生草本，别名金蚕、金线兰、金线虎头蕉等，是我国传统珍贵药材，素有“金草”、“神药”、“乌人参”等美称，在民间应用范围较广，广泛应用于风湿性关节炎、高血压、糖尿病、肾病等疑难杂症的治疗和强身健体、病后体虚恢复等方面，尤其在浙江、福建、台湾等省和东南亚地区被视为珍稀名贵药材，特别在台湾省更是倍受青睐，被称为“药中之王”。近年来，随着对其药效学和临床应用研究的深入，对金线莲药用价值的认识进一步提高，其市场货源紧缺的状况更为严峻。

金线莲种子微小，由未成熟的胚及数层种皮细胞构成，自然萌发率和繁殖率低，生产上的种苗均来自组织培养。目前，金线莲的组培育苗主要通过“不定芽的诱导、芽增殖与壮苗培养”三个阶段来实现，培养时间较长、成本较高，造成金线莲生产一直得不到较快的发展。因此，如何缩短培养时间、提高培养效率、降低培养成本已成为促进金线莲生产发展的当务之急。

发明内容

本发明的目的是提供一种药用金线莲组织培养一步成苗快速繁殖方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案包括如下步骤：

1)培养基准备

(1)配制：以1/2MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)2mg、α-萘乙酸(NAA)1.0～1.5mg、芸苔素内酯0.05mg、香蕉100g、琼脂6.5g和蔗糖25g，pH值调节至5.6；

(2)分装：将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，每瓶约50ml，稍凉后加盖；

(3)灭菌：将加入培养基的培养瓶及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为：121℃、105kPa下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用；

2)外植体处理和接种

该步骤分为两种情形，当采用自然生长的植株作为外植体时包括清洗，消毒，接种三步，其中

清洗：选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用流水冲洗2小时；

消毒：在无菌条件(水平超净工作台)下，去除叶片，将植株茎段在75％的酒精中浸润10秒后，放入10％的次氯酸钠消毒15分钟，用无菌水清洗6遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中备用；

接种：将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长约1cm、含一个茎节的若干茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接1个茎段；

当采用组培无菌苗时直接进行无菌接种，即在无菌条件下将组培无菌苗去叶，将茎切成长约1cm、含一个茎节的若干茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接1个茎段；

3)培养

将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为：温度25±2℃，光照时间每天12小时，光照强度1500～2000lx，培养时间四个月，培养期间要勤检查，发现污染的要及时去除；

4)移栽

选苗高约6～8cm、具叶3张以上、茎基直径约2mm、发根2～3条的试管苗，炼苗4天后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至1份菜园土+2份粗砂(粗2～3mm)+1份木屑，或1份菜园土+1份粗砂+2份木屑的基质中，3个月后植株成活率达95％以上，且植株挺拔、生长良好。

本发明通过合理调节激素用量及相互间的配比，促进金线莲幼苗的诱导与的生长，培养四个月后，其增殖率达4.8倍，且组培苗色绿、叶多、根壮，生长良好。移栽结果也表明，一步培养成的组培苗符合生产所需，可作为金线莲生产种苗的重要来源。

具体实施方式

1、方法和步骤实例

药用金线莲组织培养一步成苗快速繁殖方法实施例包括如下步骤：

1)培养基准备①配制：以1/2MS为基本培养基，每升添加6-BA2mg、NAA1.0mg或1.5mg、芸苔素内酯0.05mg、香蕉100g、琼脂6.5g和蔗糖25g，pH调节至5.6；②分装：将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，每瓶约50ml，稍凉后加盖；

③灭菌：将加入培养基的培养瓶及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为：121℃、105kPa下灭菌15min，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用。

2)外植体处理和接种

该步骤分为两种情形，当采用自然生长的植株作为外植体时包括清洗，消毒，接种三步，其中