[发明专利]一种单克隆抗体的制备方法及该抗体的用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽PR-39单克隆抗体的制备方法，以及用这种单克隆抗体建立ELISA检测方法。

背景技术

由于天然抗菌肽分子量小，含量低，直接提取纯化的产品纯度很低，而且成本昂贵，因此高纯度的抗菌肽免疫原难以获得，市场上缺乏抗菌肽的特异性单克隆抗体，导致对生物体内抗菌肽表达水平的研究停留在基因转录水平，难以进行翻译水平的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种单克隆抗体的制备方法，采用该方法能获得大量的特异性单克隆抗体。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种单克隆抗体的制备方法：用化学合成的抗菌肽PR-39活性中心部分肽段PR-11免疫Balb/c小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗猪抗菌肽PR-39单克隆抗体的杂交瘤株，最终得到所需抗体。

作为本发明制备方法的改进：该抗菌肽PR-39活性中心部分肽段PR-11为Phe-Phe-Pro-Pro-Arg-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile-Pro。

本发明还提供了上述方法制备的单克隆抗体的用途，用于建立酶联免疫吸附剂测定法，检测乳铁蛋白对骨髓细胞分泌PR-39水平的影响。

本发明以人工合成的猪抗菌肽PR-39活性中心部分肽段作为免疫原，应用杂交瘤技术成功制备了抗PR-39的单克隆抗体，并应用制备的单克隆抗体建立酶联免疫吸附实验。此外，还可以应用制备的抗菌肽单克隆抗体建立亲和层析法，为抗菌肽的分离纯化提供了新的方法，解决了传统分离纯化方法存在的问题。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明的抗菌肽PR-39单克隆抗体效价图；

图2是乳铁蛋白对猪抗菌肽PR-39基因表达的影响图。

具体实施方式

实施例1、人工免疫原的制备：

人工合成含有猪抗菌肽PR-39活性中心20-26位氨基酸的两个肽段：17-27位的11个氨基酸肽段PR-11(Phe-Phe-Pro-Pro-Arg-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile-Pro)和前26个氨基酸肽段PR-26(Arg-Arg-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-Pro-Phe-Phe-Pro-Pro-Arg-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile)。用碳化二亚胺(EDC)法制备免疫原PR11-OVA，Bradford法测定偶联后PR11-OVA的蛋白浓度后，分装保存于-20℃。采用同样的方法制备人工包被原PR11-BSA、PR26-BSA，分装保存于-20℃。

取8-12周龄健康雌性Balb/c纯系小鼠，采用两次基础免疫和一次加强免疫的方案，直接腹腔注射进行免疫。第1天用100μl PR11-OVA+100μl福氏完全佐剂进行基础免疫，第16天用100μl PR11-OVA+100μl福氏不完全佐剂进行第二次基础免疫，第31天直接给小鼠腹腔注射200-250μl的PR11-OVA进行加强免疫；第34天将免疫的Balb/c小鼠摘除眼球取血，收集血清作为阳性对照，放入-20℃冰箱保存备用。

颈部脱臼处死放血后的Balb/c小鼠，75％乙醇消毒后放入超净工作台取出脾脏，剪成小块，用组织研磨器制备脾细胞悬液，补加适量RPMI-1640培养液静置3-5min后，洗细胞两次，1000rpm离心5min，在用HAT培养液重悬细胞后，计数备用。融合前两周，取出冻存于液氮中的Sp2/0骨髓瘤细胞用20％胎牛血清的RPMI 1640培养液复苏培养，长成单层后传代；在准备融合的前三天更换为含20％胎牛血清的RPMI 1640培养液，保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。融合前，制备成骨髓瘤细胞悬液，用RPMI 1640培养液洗涤两次，1000rpm离心5min，悬浮于RPMI 1640培养液中，计数备用。

将制备的脾细胞与骨髓瘤细胞按照10∶1的细胞数量比例混合于50ml离心管内，0.5ml的50％PEG作为融合剂进行细胞融合。取少量HAT培养液将细胞小心吹散，然后加入96孔细胞培养板，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。一般一只小鼠免疫脾细胞能接种10块以上的96孔板。融合细胞培养3天后，用HAT培养液换掉1/2旧培养液，经过HAT培养基的选择作用，最终只有杂交瘤细胞能够生存并不断繁殖。7-10天后确认骨髓瘤细胞全部死亡后渐次换成HT培养液，以后视克隆生长情况更换新的HT培养液。