[发明专利]一种促肝细胞生长素活性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，特别是一种检测促肝细胞生长素活性的促肝细胞生长素活性检测方法。

背景技术

促肝细胞生长素是一种从新鲜的乳猪肝或小牛肝中提取的生化药品，作为治疗各种重症肝炎、慢性活动性肝炎和肝硬化的辅助用药，其活力测定即活性检测十分重要。中华人民共和国药品监督管理局的《促肝细胞生长素溶液》国家药品标准WS-10001-(HD-0860)-2002中规定促肝细胞生长素活力测定采用附一所列MTT法。该方法采用含谷氨酰胺成分的RPMI 1640培养基，包括试剂准备、供试品溶液制备、测定供试品组3孔吸收度平均值、对照组3孔吸收度平均值和空白对照组3孔吸收度平均值，最后计算出衡量供试品活性的刺激指数几个步骤。检测中发现现有技术检测方法由于RPMI 1640培养基中有谷氨酰胺成分，在活性检测过程中谷氨酰胺有促进肝癌细胞生长的作用，导致检测的细胞对照组吸收值偏高，进而导致检测计算出的刺激指数值较供试品实际具有的刺激指数值低，使测试不稳定，重复测定一致性差，从而不能正确判断供试品促肝细胞生长素的活性优劣。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的缺陷，提供一种测试方法稳定、测试结果可靠的促肝细胞生长素活性检测方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该促肝细胞生长素活性检测方法，使用RPMI-1640培养液，检测包括准备试剂步骤、供试品溶液制备步骤、测定供试品组3孔吸收度平均值、对照组3孔吸收度平均值和空白对照组3孔吸收度平均值步骤、计算刺激指数步骤，其特点是：所述的RPMI-1640培养液采用不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养液。

本发明促肝细胞生长素活性检测方法所述的不含谷氨酰胺的RPMI-1640培

养液采用不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培养基配制，所述的不含谷氨酰胺的RPMI-1640培养液配制方法为，取碳酸氢钠2.00g及不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培养基10.0g加超纯水800ml溶解后，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至6.9，加超纯水稀释至1000ml，过滤除菌备用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：由于本发明使用不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培养基，检测中不会因为谷胺酰胺促进肝癌细胞生长而影响测定结果，具有测定方法稳定、测定结果可靠等优点，测定结果能正确反映供试品的活性，对促肝细胞生长素的生产和试验有指导意义。使用本发明检测方法对同一促肝细胞生长素溶液进行3次测定，测得刺激指数2次为6.5、1次为6.7，测定误差仅为1.98％，测定一致性好，较为精确地测定了被测促肝细胞生长素溶液的活力。

具体实施方式

下面通过实施例，对本发明作进一步的阐述。

该促肝细胞生长素活性检测方法采用不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培养液，不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培养液可以选用成品试剂，也可选用不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培养基配制。

实施例促肝细胞生长素活性检测方法分试剂配制，供试品溶液制备，测定供试品组、对照组和空白对照组各3孔吸收度平均值，计算刺激指数四步骤：

1、0.01mol/L磷酸盐缓冲液、RPMI-1640培养液、10％小牛血清培养液、0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液和MTT噻唑蓝溶液等试剂配制：

①配制pH7.3的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠Na₂HPO₄ 1.15g及磷酸二氢钾0.2g，加超纯水1000ml溶解后，高压灭菌备用。

②配制RPMI-1640培养液，取碳酸氢钠2.00g及不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培养基10.0g加超纯水800ml溶解后，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至6.9，加超纯水稀释至1000ml，过滤除菌备用。

③配制10％小牛血清培养液，取上述RPMI-1640培养液900ml，加已灭活的新生小牛血清100ml。

④配制0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液，取0.25g胰蛋白酶及0.02g 乙二胺四醋酸二钠，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液100ml溶解后，用5.6％碳酸氢钠调节pH值至7.2，过滤除菌，-20℃保存备用。

⑤配制MTT噻唑蓝溶液，取MTT50mg，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液10ml溶解后，过滤除菌，保存于冷处，使用不超过两周。