[发明专利]Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备和用途

说明书

技术领域

本发明涉及应用重组DNA技术制备的基因工程蛋白药物，具体说是从毕赤酵母中表达Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白。这种融合蛋白可以作为治疗糖尿病药物的主要成分。

背景技术

Exendin-4是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物^[1]。其合成类似物Exenatide，已经由Lilly公司开发，2005年通过FDA审批上市，商品名为Byetta，本品用于治疗β细胞机能尚好，暂不需要注射胰岛素，通过口服糖尿病治疗药已无法充分控制血糖水平的糖尿患者^[2]。由于Exendin-4半衰期短，而且糖尿病患者用药几乎是终生的，因此需要多次长期给药(一天两次)。

人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)是血液中的一个非常重要的天然蛋白，在人血液循环中可以存在20天以上。研究表明将单个Exendin-4与人血清白蛋白基因融合表达的融合蛋白可降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期^[3]。

但是，将多个Exendin-4与人血清白蛋白基因融合表达的融合蛋白，是否能进一步延长其体内的作用时间国内外未见报道。Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白是利用基因工程技术制备而成的长效制剂。与Exendin-4相比，在体内的作用时间明显延长，可以减少给药次数，减轻病人治疗时的痛苦。

发明内容

本发明的目的就是根据糖尿病患者终身用药的特点，进一步地延长Exendin-4在体内的作用时间，提供一种长效的Exendin-4融合蛋白，其结构可以表示成下列结构中的任何一种：

1)E-L1-E-L2-HSA；

2)E-L1-E-L2-E-L3-HSA；

3)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-HSA；

4)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-E-L5-HSA；

5)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-E-L5-E-L6-HSA；

其中，E表示Exendin-4，HSA表示人血清白蛋白，L1-6表示肽接头；添加的肽接头是为了防止潜在的结构域相互作用而影响融合蛋白的生物学功能和稳定性。本发明中肽接头选自具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_m的多肽，其中m为0，1，2，3，4，5或6；优选为1-2个重复序列。我们最优选的融合蛋白序列见SEQ ID No：1。

为了达到上述目的，我们根据已经公开的Exendin-4氨基酸序列(www.expasy.org，Swiss-pro entryP26349)，采用酵母偏爱的密码子人工合成了含肽接头的exendin-4串联多肽基因。同时在5’端和3’端分别引入XhoI和BamHI的酶切位点。

为得到编码融合蛋白的完整基因，将exendin-4串联多肽基因的pBlueScript SK质粒，经XhoI和BamHI双酶切，经电泳后，切胶回收得到exendin-4串联多肽基因片段，再克隆到含有人血清白蛋白基因的pMD18-T载体中，然后按Invitrogen公司Pichia expression kit的说明将融合基因插入到pPIC9质粒中，转化酵母菌GS115，经过筛选并表达得到高产菌种，经甲醇诱导表达融合蛋白，具体实施方案可以参考实施例1。

收集的表达产物经亲和柱层析、疏水柱层析和凝胶柱层析顺序组合纯化，得到了高纯度的Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白。通过糖耐量实验证明Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白比单个Exendin-4与人血清白蛋白的融合蛋白的作用时间明显延长。

本发明的另一个目的是提供一种制备本发明的融合蛋白的方法。

本发明的另一个目的是得到的纯化Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白，在制备治疗糖尿病药物中的应用。

本发明的另外一个目的是得到Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白在制备减肥制品中的应用。

本发明具有的特点是：

1)采用酵母偏爱的密码子，人工合成了Exendin-4串联多肽的基因片断。