[发明专利]一种利用原位合成微流体芯片的检测方法

权利要求书

1、一种利用原位合成微流体芯片的检测方法，其特征是包括以下步骤：

1)、利用现有模式植物上公开报道的非编码小RNA的序列，优选miRNA的序列信息，依据其正义链或其负义链序列设计互补的寡核苷酸杂交探针，用于制作植物sNC-RNA或miRNA的检测芯片；

2)、用原位合成方法制备寡聚核苷酸芯片，并通过与DNA互补探针杂交以检测其特异性和灵敏度；

3)、从待检测植物中提取小于50核苷酸碱基的小RNA，进行末端标记后与上述芯片中的探针杂交，获得芯片杂交的结果，进行定性和定量分析。

2、根据权利要求1所述的利用原位合成微流体芯片的检测方法，其特征是，所述步骤1)为：收集源自高等植物的miRNA序列或者是根据生物信息学预测的序列；然后通过序列比对，去除冗余序列后获得成熟非编码小RNA序列；再根据上述非编码小RNA序列设计互补探针，探针包括成熟miRNA的互补序列及其相同的序列，探针大小为全长的或近全长的非编码小RNA。

3、根据权利要求1或2所述的利用原位合成微流体芯片的检测方法，其特征是，所述步骤2)为：

先采用原位合成技术在微流体芯片上合成序列互补探针：

在原位合成微流体芯片上，依次合成化学修饰过的寡聚核苷酸探针序列和延伸臂片段，所述寡聚核苷酸探针序列为miRNA互补序列、单链cDNA；所述延伸臂片段使与其连接的寡聚核苷酸探针序列片段离片基有一定的距离，延伸臂为在miRNA探针基部的8～25个碱基的非特异性序列，是已知动物或人类基因组序列中与植物miRNA同源性低于25％的序列；

然后再进行芯片质量检测：

对合成好的芯片在芯片扫描仪上进行荧光分析，以检测芯片本身的荧光本底；用质控cDNA或体外转录获得的小RNA进行末端标记后与芯片进行杂交，包括用已知样品进行标记、杂交和检测，以分析芯片特异性、灵敏度和重复性。

4、根据权利要求3所述的利用原位合成微流体芯片的检测方法，其特征是，所述步骤3)为选用以下两种方法中的任意一种：

方法A、用常规方法或试剂盒从待检测植物中提取小于50nt的RNA，用末端标记试剂进行末端标记后与上述芯片探针进行杂交，用扫描仪(如GenePix 4000B，Molecular Device)扫描芯片，获得杂交图谱；

方法B、用芯片分析软件获取每个探针的荧光信号强度和标准误，信号值经过背景噪音减除后，通过调整该扫描通道下的平均信号值到同一水平对数据进行归一化处理；

对以上获得的数据可以进行横向或纵向的比较分析，相同合成条件下获得的芯片，其杂交数据也可以进行对比分析，确定检测结果。