[发明专利]含毛囊人工皮肤的制备方法及由其制备的人工皮肤

说明书

技术领域

本发明属生物医学，涉及人工皮肤的制备方法，尤其涉及含毛囊人工皮肤的制备方法以及由该方法制备得到的人工皮肤。

背景技术

最近国内外已成功地研制出含有真皮和表皮的人工皮肤，但这些人工皮肤尚没有其他细胞成份，如无皮脂腺腺体细胞，皮脂腺分泌的产物称皮脂，有润滑皮肤的作用，在皮肤表面形成脂膜，形成皮肤屏障(skin barrier)的一部分。脂膜中的游离脂肪酸对某些病原微生物的生长起抑制作用；毛囊周围真皮组织中的成纤维细胞能产生天然抗生素，有抗菌防御能力。毛囊中的外毛根鞘相当于表皮的棘层和基底层细胞，具有表皮修复能力，这些细胞还存在有多种细胞因子受体，又能分泌重要的细胞因子，成为皮肤细胞信息交换的重要场所。

因此，如果在人工皮肤中具有上述细胞成分，人工皮肤就会在功能上较为完善。由于毛囊在皮肤中的重要作用，研制出一种具有一定生理功能的含毛囊的人工皮肤对研究创面的正常化愈合具有重要的理论意义和应用前景。

目前临床上适用于大面积创面覆盖的人工皮肤主要是以胶原等天然材料为支架的人工皮肤，该类人工皮肤具有培养面积小、产量低、易收缩和移植成功率低等缺点；或是以合成材料为支架的，虽易生产，但易于感染，移植成功率低，没有表皮层，不利于细胞生长；人工皮肤的研究重点集中在基质的改善和抗感染能力方面，对人工皮肤中的细胞成份研究较少，虽然近年来国内外已成功地研制出含真皮和表皮的人工皮肤，并具有一定的抗感染能力。

毛囊是细胞生物学和皮肤病学等学科的研究热点，它涉及毛囊真表皮间相互作用、信号传导、生长因子和细胞因子的作用、毛囊生长周期的调控、毛发的色素、毛发的定型、毛囊干细胞的定位及其生物学功能等多个方面，现在已初步阐明毛囊干细胞定位于毛囊外根鞘的立毛肌附着处。如何利用皮肤毛囊干细胞在人工皮肤中发挥重要的生理功能已成为发展趋势。

毛囊的功能：毛囊是皮肤的主要辅助器官，它具有重要的生理功能：如皮肤的屏障作用，抗菌作用，抑制疤痕形成作用；同时毛囊是表皮-毛囊-皮脂腺单位干细胞的所在部位，在适当的环境因素刺激下毛囊干细胞可定向分化为表皮、毛囊和皮脂腺组织，这些组织细胞及其细胞因子对创面的正常化愈合具有不可替代的作用。

我们的前期研究应用鼠触须毛囊细胞在胶原/壳聚糖多孔支架上成功地研制出含毛囊的人工皮肤(专利申请号为：200510050538.4)，其公开了一种含毛囊人工皮肤的制备方法，通过以下步骤实现：分离鼠触须毛囊，加入分离酶消化，离心，得毛囊上皮细胞；取去除毛干的鼠触须毛囊用胶原酶D消化，离心，用DMEM培养基进行真皮鞘细胞培养和进行毛乳头细胞培养；将传代培养的细胞分别与毛囊上皮细胞按5-1∶1-5比例进行混合，移植到胶原/壳聚糖多孔支架上，加入DMEM培养基培养即得。该发明方法解决了大面积烧创伤中皮肤来源困难的难题。但由于所用细胞来源于动物，因其抗原性使其临床应用受限，如果能用人的毛囊细胞研制出含毛囊的人工皮肤，将会大大缩短临床应用研究时间。对研究创面的正常化愈合和大面积烧伤的创面覆盖具有重要的理论意义和应用前景。

发明内容

为了解决上述的人工皮肤所用细胞来源于动物，因其抗原性使其临床应用受限的技术缺陷。本发明的一个目的是提供一种含人毛囊人工皮肤的制备方法，其使人工皮肤得抗原性大大减弱，解决了大面积烧创伤中皮肤来源困难的难题。

本发明的另外一个目的是提供由上述的制备方法得到的含毛囊人工皮肤。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

含毛囊人工皮肤的制备方法，其包括以下步骤：

(1)毛囊上皮细胞制备：分离人头皮毛囊，加入分离酶，消化，再将毛囊移入缓冲盐溶液中，飘洗去除分离酶，从毛囊中挤出毛干，用0.125-0.25％胰蛋白酶加EDTA消化成单个毛囊上皮细胞，离心去除胰蛋白酶，用角质形成细胞培养基培养备用；

(2)毛乳头细胞培养：将去除毛干的人毛囊用0.1-0.5％的胶原酶VI消化，待包绕毛囊的真皮鞘消化成单细胞而其内的毛乳头尚未开始消化时，中止消化，液洗，低速离心去除胶原酶VI，吸沉淀过200-400目的筛网，倒冲筛网，用角质形成细胞培养基培养，进行毛乳头细胞培养备用；