[发明专利]一种晚香玉病毒的离体繁殖方法

权利要求书

1.一种晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于：该方法按以下步骤进行：

1)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

(1)基本培养基：诱导、增殖及生长培养基用MS培养基；生根培养基用1/2MS培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～6.0；

(2)诱导培养基：MS+6-苄基嘌呤1.0～3.0mg/L和吲哚乙酸1.0～3.0mg/L；

(3)增殖培养基：MS+6-苄基嘌呤0.5～2.0mg/L和吲哚乙酸0.5～2.0mg/L；

(4)生长培养基：MS+6-苄基嘌呤0.1～1.0mg/L和吲哚乙酸0.1～1.0mg/L；

(5)生根培养基：1/2MS+吲哚丁酸0.5～2mg/L和吲哚乙酸0.1～0.5mg/L；

2)、毒源晚香玉的组织培养：

(1)外植体的选取与灭菌：选取毒源鳞茎，剥除鳞茎外皮用自来水冲洗洗净，经灭菌处理后，在无菌条件下，切取幼芽或将鳞茎切成0.5cm×0.5cm×0.5cm见方的切块作为组培用外植体；

(2)诱导培养：将幼芽或鳞茎切块接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30～45天，从幼芽诱导成丛生芽或从鳞茎切块诱导形成幼芽；

(3)增殖培养：将丛生芽或幼芽转接到增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天至增殖出丛生芽；根据对幼芽数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行幼芽再增殖；

(4)生长培养：将增殖的丛生芽转接到生长培养基上，在培养条件下培养30～45天使丛生芽长高到3～5cm；

(5)生根培养：将长大的丛生芽切成单株转接在生根培养基中，在培养条件下培养20～30天，基部长出数根根系；

(6)移栽：当生根组培苗长高至5～7cm以上、长出5根以上根时，移栽至基质中，培育1～2个月后成苗；

3)、病毒检测：

(1)病毒提纯：

取组培苗叶片或移栽成苗的叶片，低温保存，利用差速离心结合经二轮PEG沉淀的分离法，对组培苗叶片或移栽成苗的叶片的病毒进行分离、纯化，获得病毒制剂；

(2)病毒制剂含量检测：

利用免疫电镜捕获法及负染电镜法检测毒源晚香玉病毒含量、纯度；

(3)病毒ELISA检测：

将田间晚香玉发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对组培苗进行病毒ELISA检测，鉴定其病毒种类；

(4)病毒的致病力测定：

利用常规摩擦法，接种晚香玉测定毒源晚香玉体内病毒的致病力；

4)、毒源晚香玉病毒的离体繁殖：

将步骤2)增殖的组培苗经病毒检测后带有病毒的丛生芽，根据对毒源幼芽数量的需求，每隔30～45天按将步骤2)同样方法进行毒源幼芽再增殖。

2.根据权利要求1所述的晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于，所述的各组培阶段的培养条件是，培养温度为25±2℃，光照光强为2200～2500Lx，光照时间为16h/d。

3.根据权利要求1所述的晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于：所述的移栽基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比1∶3∶2配制而成。