[发明专利]白菜雄性育性相关基因BcPW1及其分离方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，本发明涉及白菜雄性育性相关基因BcPW1及其分离方法。

背景技术

植物雄性不育是指两性花植物的花粉花药异常导致花粉功能丧失的现象，在被子植物中普遍存在。利用植物雄性不育特性来选育雄性不育系是作物杂种优势利用中简化制种程序、降低制种成本的重要手段。植物雄性不育产生的机理极其复杂，至今仍不清楚。从发育分子生物学角度看，花粉败育是植物雄性不育发生的表型体现。而花粉发育是一个多步骤复杂的过程，涉及众多基因的表达调控。随着实验方法的不断改进，近年来已经分离鉴定了众多花粉表达基因(Becker et al.，2003；Lee and Lee，2003；Honys and Twell，2003，2004；Pina et al，2005)。然而，在日渐累积的已鉴别的花粉表达基因中，大部分是功能未知的。例如在已经精确定位的模式植物拟南芥的30 000个基因中，有50％为功能未知，尽管其中任何一个都可能和与某个农艺学性状相关(Parkin et al，2005)，但功能未知即阻碍了其在生产中的应用。花粉中这些未知功能的基因可能编码新的在花粉和花药发育中起作用的蛋白质。因此，对这些新基因进行进一步研究，不仅将丰富对花粉发育相关基因的认识，有助于深入理解花粉发育及雄性不育产生的分子机理，同时也为农业生产中利用基因工程进行育种实践奠定了基础。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种白菜雄性育性相关基因BcPW1及其分离方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种白菜雄性育性相关基因BcPW1，它包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

进一步地，所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No.2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

一种权利要求1所述的白菜雄性育性相关基因BcPW1的分离方法，包括以下步骤：

(1)Bc-A17T17片段的分离：用A17/T17引物对白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异进行cDNA-AFLP分析，检测到在可育株系花蕾中特异表达的基因条带Bc-A7T17，用手术刀片割下聚丙烯酰胺凝胶上的差异片段，溶于100μL TE，并作为模板进行PCR扩增，条件与cDNA-AFLP中的预扩增相同；PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳，经凝胶回收试剂盒纯化；回收产物连接到pGEM-T Easy Vector(Promega)并转化到E.coliDH 5α感受态细胞，经蓝白斑筛选重组质粒，测序，最后RT-PCR验证得到该条带的核苷酸序列；

(2)Bc-A17T17片段相关的基因的cDNA的3’末端和5’末端扩增：根据双链cDNA合成试剂盒中接头及引物特征设计3’RACE和5’RACE锚定引物P3和P5；根据差异片段Bc-A17T17设计正向特异引物S1和反向特异引物A1，正向特异引物S1与锚定引物P3扩增3’末端，反向特异引物A1与锚定引物P5扩增5’末端；锚定引物P5的序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；锚定引物P3的序列为：5’-GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3’；正向特异引物S1序列为5’-GTTCTACTTCTACATCAGACTCC-3’；反向特异引物A1序列为5’-TTACTAGTTTGCCAACTTGGTGAAG-3’；PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒回收，插入pGEM-T Easy载体，转化DH 5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定后，重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序，得到Bc-A17T17片段相关的基因的cDNA的3’末端和5’末端；

(3)BcPW1基因的全长克隆：根据两端拼接的cDNA全长序列设计特异引物T1和T2，所述T1序列为5’-GCGTCTAGAGAGGTCATTCAATTC-3’，和T2序列为5’-A TAGGATCCATAGGTCGGTCAATA-3’；常规PCR方法再次从花蕾cDNA中扩增Bc-A17T17片段相关基因的cDNA序列；用同一特异引物对在基因组DNA中扩增得到其DNA序列SEQ ID No.2。