[发明专利]一种干细胞体外衍生化肝细胞模型的应用

说明书

技术领域

本发明属发育生物学和药理学领域，涉及一种模型的用途，具体涉及干细胞体外衍生化肝细胞模型在肝脏发育能量代谢研究中的应用，可用于以过氧化物酶体增殖激活受体为靶点的促细胞分化剂筛选。

背景技术

小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES cell)体外定向分化为肝细胞体系能模拟体内肝细胞形成和发育，富含大量肝脏发育依赖性生物信息。该系统中肝细胞多种关键基因表达高于原代成熟肝细胞；具有白蛋白合成和氨降解功能；代谢功能也比原代肝细胞强，维持时间长，因此无论结构还是功能均高度模拟整体环境，该模型可用于肝脏发育学和组织工程研究，在药学研究领域非常适用于药物调控各种基因、蛋白表达谱和与药物代谢作用的研究。

过氧化物酶体增生物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)是由独立基因编码的一类孤儿核受体，属于II型核受体超家族成员，可调节众多靶基因的转录过程，参与糖类、脂类代谢以及细胞增殖分化、炎症等多种病理生理过程。在低等脊椎动物和哺乳动物中存在3种亚型：PPAR-α、PPAR-β(又称PPAR-δ)、PPAR-γ。这三个成员在表达模式，组织分布以及对应的配体上都存在差异。PPAR-α主要在棕色脂肪组织、肝脏、肾脏、十二指肠、心脏、骨骼肌和血管内皮细胞中表达，与控制脂蛋白代谢、脂肪酸氧化、细胞摄入脂肪酸有关。PPAR-β组织分布广泛，与脂质代谢和皮肤的平衡态有关，还与动物的生殖发育，胚胎着床与发育等有关。PPAR-γ在棕色和白色脂肪组织中高度表达，与脂质代谢、血管炎症和促成动脉粥样硬化等有关，并在脂肪分化和脂肪蓄积方面发挥着重要作用。上述大量研究表明调节脂质代谢和储存的大量相关基因都是受PPARs家族调控，除此之外，PPARs对某些细胞分化的调节也有一定作用，如心肌细胞，神经细胞，脂肪细胞以及一些肿瘤细胞。但对PPAR家族在肝脏生理和分化发育过程中的表达模式和作用所知甚少。

肝脏是能量需求旺盛的器官，肝细胞是线粒体数目丰富的一类细胞。随着肝脏组织不断发育成熟，必然伴随着线粒体数目上调和能量需求增加，任何干扰线粒体形成的因素将会影响肝脏细胞的最终分化。线粒体的形成包括氧化磷酸化酶系表达，TCA循环形成以及脂肪β氧化酶系表达，而调控线粒体形成相关基因转录和蛋白表达的主要是几类核转录因子及其辅激活因子，其中包括PPARs。PPARs可以调节细胞的分化、增殖和生存。PPARs在肝脏脂质代谢功能方面发挥重要调节作用，其功能改变与一些肝脏疾病的发生发展存在某种相关性。小鼠ES细胞体外分化为肝细胞真实地重现了体内肝细胞分化过程，已作为一个替代模型广泛用于各种研究，迄今未见干细胞衍生化肝细胞模型在肝脏发育能量代谢研究中的应用。

发明内容：

本发明的一个目的是提供小鼠胚胎干细胞衍生化肝细胞模型在肝脏发育能量代谢研究中的应用，是在利用肝脏发育能量代谢相关的PPARs家族表达谱和功能揭示胚胎肝脏发育的生命现象本质中应用。即是利用干细胞衍生化肝细胞模型阐明肝脏发育能量代谢相关的PPARs家族表达谱和功能，用于揭示胚胎肝脏发育的生命现象本质。

所述应用是在筛选与评价调节肝脏能量供应的能量代谢诱导剂药物中的应用。可在以过氧化物酶体增殖激活受体为靶点的促细胞分化剂筛选中应用，是用于构建以PPARs家族为靶点的高效率药效筛选模型，进行调节肝脏能量供应药效初步筛选与评价，发现新一类促进干细胞分化为肝细胞的能量代谢诱导剂。

本发明所述小鼠胚胎干细胞体外衍生肝细胞模型通过以下步骤构建：采用悬滴培养法，将ES细胞以600个细胞/30μl滴的密度接种于培养皿盖子内表面上，然后翻转盖子，使盖子上的小滴倒挂成悬滴，培养5天形成拟胚体(embryoid body，EB)，再将EB转移到放有用明胶包被的24孔板内进行贴壁培养，此时开始用倒置显微镜每天观察细胞，以捕捉肝细胞定向分化的形态变化。同时采用免疫荧光法检测肝细胞特异性蛋白表达，以白蛋白特异性染色确定ES细胞分化而来的是肝细胞。

本发明在细胞层面上对干细胞衍生化肝细胞模型在肝脏发育能量代谢研究中的应用做了论证，对其中蕴藏的大量生物学信息进行了初步探讨，具体有以下优点：

1.本发明开拓了干细胞衍生化肝细胞模型的一种新用途，即能作为肝脏发育能量代谢研究的替代模型。

2.本发明明确了肝脏线粒体能量系统发育相关的PPARs家族表达特征，该模型可用于以PPARs为靶点的促肝细胞能量代谢分化剂筛选。

附图说明