[发明专利]细胞色素P450 BM－3 D168R变体酶以及应用其制备靛玉红的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程中的基因工程领域和生物制药领域，具体地说是涉及 具有新的催化性质的细胞色素P450BM-3D168R变体酶、其基因及这种酶在生 物催化中的用途，特别是在靛玉红制备中的应用。

背景技术

靛玉红是我国科学家上世纪经过多年研究从传统药方当归龙荟丸中发现的 一种新型的白血病治疗药物。上世纪六十年代中期，中国医学科学院血液病研 究所在慢性粒细胞性白血病的治疗研究中发现当归龙荟丸具有较好的疗效，经 过中国医学科学院血液病研究所与成都中医学院等多家机构对该丸剂中11种成 分历时10多年的药理分析，其中的青黛最终被确定为抗白血病的有效组分。经 过进一步的研究，从青黛中分离得到的靛玉红被确认为确切的抗白血病成分并 在临床试验中得到验证。采用靛玉红治疗慢性白血病具有起效快、疗效显著， 剂量小，副作用小等优点，特别是靛玉红对机体免疫功能无抑制、对机体正常 的造血功能无明显影响，显著优于马利兰等传统化疗药物，目前靛玉红已成为 治疗慢性白血病的临床用药。靛玉红的发现及其在慢性白血病治疗中的成功应 用是我国科学家在白血病治疗领域应用传统中药遗产做出的卓越贡献。

随着对靛玉红治疗机理研究的进一步深入，国内外科学家发现靛玉红及其 衍生物除了用于白血病治疗外还能用于多种癌症的治疗。研究发现：靛玉红能 抑制细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)，从而抑制细胞增殖；靛玉红及其衍生 物可结合在一些重要细胞周期调节子的ATP结合位点上，对实验性实体瘤具有 广谱抑制作用；某些靛玉红衍生物可诱导包括人乳腺癌细胞和前列腺癌细胞在 内的肿瘤细胞凋亡。尤其引人注目的是靛玉红对CDK的抑制具有广谱性，即它 对一个家族的蛋白激酶都具有抑制活力，而这些激酶恰好是某些特定肿瘤中出 现异常的激酶。英国牛津大学分子生物物理实验室的Jane Endicott教授认为， 这种特异地同时对一定数量靶点起作用的化合物对癌症治疗具有重要价值，因 为如今已逐渐认识到单靶点治疗癌症的作用有限，因为癌细胞常常能逃避单一 靶点的抑制。靛玉红及其衍生物的这种相对广谱的选择性激酶抑制特性使它们 成为了未来极具潜力的抗癌药物。

除白血病和癌症治疗外，靛玉红在其他疾病治疗方面也极具价值。我国曾 开展了利用靛玉红治疗银屑病的研究并取得了较好的治疗效果；英国阿伯丁大 学的研究人员正研发能专一抑制疟原虫的靛玉红衍生物。

靛玉红作为一种从传统中药中发现的具有多种治疗用途的物质，已成为一 种高附加值的天然产物，目前国内报价为6-8万人民币/公斤。这一方面是因为 国际、国内市场对其需求量很大，另一方面也与靛玉红在天然植物中的含量很 低有关。现在可用于靛玉红提取的中药材有大青叶、板蓝根多种，但即使在靛 玉红含量最高的大青叶中，靛玉红相对于大青叶干重的含量也仅为0.03％左右； 《中国药典》2005版中就规定大青叶干燥品中靛玉红含量不少于0.02％即为合 格。这不仅使得靛玉红生产成本高、产品价格昂贵，而且生产过程还会消耗大 量的有机溶剂和能源，造成环境负担。此外，由于天然药材资源有限，如果原 料药材大量从自然界获取将破坏生态平衡；如果采用人工种植，又会产生与粮 争地的问题。

虽然靛玉红也可以通过化学合成生产，但目前青睐天然产物的潮流和化学 合成产物的复杂性使得天然靛玉红更受重视和欢迎。

为了克服从天然植物植物中提取靛玉红的诸多不足，人们提出了其他的获 得天然靛玉红的方式。随着可持续发展观念和环保法规的强化，在节能减排的 大趋势下，目前人们已尝试采用生物技术、通过生物催化与转化的方法来获得 天然靛玉红。

一种途径是采用组织工程手段对蓼蓝进行发根组织培养，期望通过培养条 件的优化提高靛玉红的含量、并结合工业化的生产方式降低生产成本。但是要 使蓼蓝中的靛玉红含量发生显著地提高并非易事，兼之组织培养的复杂性，这 种方法目前仅有学术研究的文献报道，尚未实用化。