[发明专利]检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸及其检测方法

权利要求书

1.检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其包括在底板上依次粘贴的样品吸收垫、胶体金标记垫、检测反应区及吸收垫，检测反应区上设有包被有检测用抗原的检测线和包被有二抗的质控线，其特征在于：胶体金标记垫所包被的物质为一种生物毒素抗体或多种生物毒素抗体的胶体金标记物的混合物，所述的检测线的条数与胶体金标记垫包被生物毒素抗体的数目相应，每条检测线上分别包被有与胶体金标记抗体相应的单一的生物毒素检测用抗原。

2.根据权利要求1所述的检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：生物毒素抗体分别为玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1、赭曲霉毒素A或呕吐毒素的多克隆抗体或单克隆抗体中的一种或多种，检测用抗原相应的分别为玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1、赭曲霉毒素A或呕吐毒素的检测用抗原中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：所述试纸为呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1四联检测试纸；呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A三联检测试纸；呕吐毒素、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1三联检测试纸；赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1三联检测试纸；呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1三联检测试纸；赭曲霉毒素A和伏马菌素B1三联检测试纸；呕吐毒素和赭曲霉毒素A二联检测试纸；玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A二联检测试纸；呕吐毒素和玉米赤霉烯酮二联检测试纸；呕吐毒素和伏马菌素B1二联检测试纸；伏马菌素B1和玉米赤霉烯酮二联检测试纸；赭曲霉毒素A检测试纸；玉米赤霉烯酮检测试纸；伏马菌素B1检测试纸中的一种。

4.根据权利要求1所述的检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：生物毒素抗体为生物毒素单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：所述的生物毒素单克隆抗体制备的方法如下：

a、免疫动物培养；

取健康6-10周龄小鼠进行免疫；第一次基础免疫将0.5-1.0mg/mL生物毒素免疫用抗原与等量完全弗氏佐剂用搅拌器充分混匀乳化，进行皮下多点注射；三周后开始进行加强免疫，剂量同上，佐剂换为不完全弗氏佐剂，二免后，定期测定抗体效价，每隔三周加强免疫一次；

b、脾细胞悬液的制备：

取效价高的小鼠，处死，酒精浸泡消毒10min，在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数；

c、细胞融合和克隆化：

取对数生长的骨髓瘤细胞，1000rpm离心3～7分钟，离心，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤；同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤；将骨髓瘤细胞与脾细胞按比例混合在一起，在塑料离心管内用不完全培养液洗，1200rpm，5～10分钟离心；弃上清，并使细胞沉淀略加松动；

在室温下融合：加入预热的PEG，边加边搅拌；加预热的不完全培养液，终止PEG作用；离心，弃上清，先用小牛血清轻轻混悬；将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的微孔板中培养；融合一天后，加HAT选择培养液；融合后6～8天，用HT培养液换液1～2次，在11～14天后根据增殖情况改用NBS的完全培养液；待集落长至孔底1/4～1/2时，可取上清检测相应的特异性抗体；细胞完全克隆化后，将细胞注入小鼠腹腔，将腹水用蛋白A免疫亲和层析纯化后，即得到生物毒素单克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：检测用抗原为生物毒素与载体物质偶联形成的偶合物，其中，所述的载体物质选自蛋白质或蛋白质片段中的一种。

7.根据权利要求6所述的检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：载体物质选自牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白与甲状腺球蛋白中的一种。