[发明专利]一种重组内切几丁质酶基因序列及其重组载体

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列和含有该重组内切几丁质酶基因的重组载体。

背景技术

几丁质又称甲壳素，化学名为(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的天然高分子氨基多糖类化合物，广泛存在于低等植物菌类、藻类的细胞和甲壳动物虾、蟹、昆虫外壳以及高等植物的细胞壁中。自然界中几丁质年生物合成量近一百亿吨，其中10％来自于海洋，是地球上仅次于纤维素的第二大可再生资源，但遗憾的是这一资源未被充分利用而作为废物自然流失，不仅造成了巨大的浪费，而且还导致了严重的环境污染。大量的废弃几丁质资源由于没有行之有效的处理方法或因处理效果不好长期存在于自然环境中，在一定条件下会发生化学的、物理的或生物的转化，对周围环境造成一定的影响。污染成分不仅通过水、气、土壤、食物链等途径污染环境，成为大气、水体和土壤环境污染的“源头”；同时又是各种病源微生物的孽生地和繁殖场，形成病源型污染，严重危害人体健康。如何充分利用这些几丁质资源，使之变废为宝，消除其对环境的污染，成为目前急需解决的重要问题。

近年来人们逐渐发现几丁质的中间降解产物几丁寡糖具有区别于单糖的某些独特的生理功能：增强人体免疫机能；促进脾脏抗体的形成；抗肿瘤及抑制肿瘤转移；降低胆固醇和血脂的含量；抗血栓、降血压、降血糖、抗凝血、抗菌和抑菌等生物活性并能选择性地活化和增殖人体肠道内的有益菌；消除体内霉素，调节生理机能，延缓衰老；强化肝脏机能，阻碍病原菌生长繁殖和排除体内重金属等，已被科学界列为人的生命第六要素，是目前发现的唯一的阳离子动物性膳食纤维，在医药、保健、化工、食品、环境和农业等领域具有广泛的应用前景，附加值高，因此几丁寡糖的生产已成为开发利用几丁质原料的一条重要途径。

几丁质可通过酸法或酶法降解。酸法降解能耗大，降解程度难以控制，降解产物主要为单糖，降解过程中产生的含硫酸或盐酸的废水直接排放或加碱中和后排放到环境中，对环境造成严重的二次污染。酶法降解具有反应条件温和，能耗低，无需昂贵设备和对环境友好等优点，因而具有良好的应用前景。几丁质可通过几丁质降解酶系作用而降解。根据反应初级产物类型和水解切口位置的不同，几丁质降解酶系可分为内切几丁质酶、外切几丁质酶和几丁二糖酶。内切几丁质酶从几丁质链的内部切割β-1，4糖苷键，产生几丁寡糖；外切几丁质酶从几丁质链的非还原性末端依次切割β-1，4糖苷键，产生几丁单糖；几丁二糖酶则专一性的将几丁二糖降解为几丁单糖，因此研制高效廉价的内切几丁质酶是催化几丁质降解成几丁寡糖的关键所在。

巴斯德毕赤酵母表达系统现在已经发展成为一种高效的外源蛋白基因优秀表达系统，具有高表达、高稳定、高分泌、易适应大规模工业化发酵和培养成本低等优点。为了能够提高内切几丁质酶蛋白的表达量，本专利首先根据巴斯德毕赤酵母基因组中各种氨基酸密码子的使用频率，设计合适的引物，采用PCR技术合成了基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的内切几丁质酶基因序列，然后构建了含有该目的基因序列的表达载体pSECH，最后将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的巴斯德毕赤酵母中，构建高分泌型内切几丁质酶巴斯德毕赤酵母工程菌，实现高效廉价内切几丁质酶的产业化生产，具有广阔的应用前景，经济、生态环境效益将非常明显。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的又一个目的在于提供一种含有上述重组内切几丁质酶基因的重组载体和由该重组载体转化的巴斯德毕赤酵母宿主。

本发明采用现代生物技术，利用PCR合成了基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因，构建了微生物表达载体，再将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的巴斯德毕赤酵母中，构建高分泌型内切几丁质酶工程菌，可实现高效廉价内切几丁质酶的产业化生产，具有广阔的应用前景，

附图说明

图1表示重组内切几丁质酶基因的真核表达载体的构建。

具体实施方式

实施例1.基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列的获得

根据巴斯德毕赤酵母密码子的偏爱性和内切几丁质酶的基因序列，设计以下引物：