[发明专利]人巨细胞病毒UL122基因的siRNA序列及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术，涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及针对人巨细胞病毒(HCMV)UL122基因的siRNA序列的设计、筛选及其在体内外抑制HCMV的应用。

背景技术

1.HCMV的治疗现状

HCMV属β疱疹病毒亚科，在人群中感染广泛，但大多为无症状的亚临床感染。HCMV感染在免疫功能低下的人群(如AIDS、器官移植患者等)中则可引起多系统的严重疾病，且可能与多种恶性肿瘤的发生有关。同时，HCMV也是导致先天畸形和新生儿出生缺陷的最主要的感染性因素。因此，防治HCMV感染一直是国内外医学关注的热点之一。目前，HCMV的治疗药物主要包括更昔洛韦(ganciclovir，GCV)、膦甲酸钠(fascarnet，FOS)和西多福韦(cidofovir，CDV)，但是由于药物毒副作用和HCMV耐药株的出现，急需探索新的治疗途径控制HCMV感染。

2.UL122基因及其表达蛋白的研究现状

HCMV的基因组表达具有一定时序性，可分为即刻早期(IE)、早期(E)和晚期(L)三种时相蛋白。主要IE基因UL122经过选择性剪接产生长度分别为2.25kb(外显子1，2，3，5)和1.70kb(外显子1，2，3，5’)的mRNA，分别编码IE₂86(86kDa，580个aa)和IE₂55(55kDa，425个aa)两种核磷蛋白。研究表明，UL122基因是HCMV的增殖必需基因，缺失UL122的HCMV突变株不能产生增殖性感染。UL122基因编码的IE₂86蛋白在病毒复制和调节宿主细胞周期等方面发挥关键作用。IE₂86不仅能够反式激活多种病毒和细胞的启动子，而且也能作为抑制子下调主要IE蛋白的表达。另外，IE₂86通过多种途径抑制被感染宿主细胞的凋亡，包括：与凋亡诱导因子p53结合使其失活；通过干扰p53的修饰抑制其激活；阻止不依赖p53的凋亡通路如TNF调节的死亡受体信号途径；诱导NF-κB转录，在适当条件下NF-κB通过诱导cIAPs阻止细胞凋亡。

3.RNA干扰的研究现状

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是序列特异的双链RNA(dsRNA)使细胞内同源mRNA降解，从而产生特异性基因表达沉默的过程。它是机体的一种小分子RNA介导的序列特异性免疫保护机制，可以对抗侵入性遗传因子的作用。自1998年首次被报道以来，RNAi技术以其特有的优越性而被迅速应用于抗病毒及其相关方面的研究中，目前已在HIV、HBV、HCV、流感病毒等的抗病毒研究中取得重要进展。

RNAi的作用主要由长约21～23nt的dsRNA介导，其中一类称为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，它和目的mRNA序列具有严格的配对，能引起相应mRNA降解。由于RNAi是siRNA靶向作用mRNA引起的特异性降解，因此要产生有效RNAi的关键是选择合适的siRNA作用靶点。目前RNAi靶点的选择原则可以概括为以下几点：①选择GC含量在50％左右的mRNA区域；②避免选择启动子起始部位下游50～100nt以内或终止子上游50～100nt内的区域；③避免超过三个G或三个C的重叠，因为多聚G或多聚C能形成类聚物而干扰RNAi的沉默机制；④选择以两个AA开始的序列，这将使合成siRNA更加容易；⑤保证靶序列与其他基因没有同源性。目前，制备siRNA的方法主要包括化学合成法、体外转录法、长片段dsRNA经RNase III降解法、siRNA表达载体转录法及PCR制备的siRNA表达框法等5种。

发明内容

本发明的目的是提供一种HCMV UL122基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是：5’-GCATGTTCCGCAACACCAATC-3’。

本发明的另一个目的是提供该cDNA序列在制备治疗人巨细胞病毒感染的药物中的应用。

本发明根据siRNA设计原则，选择的siRNA其cDNA序列的GC含量为52.4％，对应UL122mRNA中1103-1123核苷酸位点；构建针对HCMV UL122基因的siRNA真核表达载体，转化大肠杆菌后提取质粒，转染AD293细胞，可有效抑制UL122基因mRNA和蛋白表达水平，因此可应用于HCMV治疗药物的制备。