[发明专利]生产低醇啤酒的酿酒酵母

说明书

技术领域：

本发明涉及一种利用生物工程方法构建生产低醇啤酒的酿酒酵母。 

背景技术：

低醇啤酒既具有啤酒应有的啤酒风味，又具有多饮不醉的优点，同时也符合当今消费者日益重视身体健康的消费趋势，加上妇女对酒精过敏男士对低醇啤酒的喜爱，低醇啤酒正在走俏。 

啤酒乙醇的含量是决定低醇啤酒的关键指标，它直接关系到啤酒的品质。如何解决啤酒中乙醇的含量是生产低醇啤酒的关键。目前，降低啤酒中乙醇含量的办法有很多种，其中最理想的方法之一就是构建低醇啤酒基因工程菌株，通过对工业用酿酒酵母本身进行改造来生产低醇啤酒。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种通过基因克隆技术，将出发工业用酿酒酵母菌株进行了基因改造的方法，从而构建可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株。 

上述的目的通过以下的技术方案实现： 

生产低醇啤酒的酿酒酵母，其组成包括：选取工业用酿酒酵母菌株，菌株拉丁名：Saccharomyces cerevisiae，保藏在：CCTCC保藏号：M207161。 

生产低醇啤酒的酿酒酵母，HDY-01(原始菌株)酵母、ΔADH I(缺失乙醇脱氢酶)酵母、BADH I-ΔADH I酵母菌分别接种于100毫升YPD液体培养基中，30℃，200转/分钟，过夜培养，作为种子液。然后以1∶4的接种量接种于麦芽汁培养基中12℃低温发酵15天，分别测定每天的发酵参数。其中乙醛利用气相色谱Agilen仪6890型号测定，双乙酰利用气象色谱测PE Claus500型号测定，乙醇利用蒸馏密度瓶法测定，残糖利用糖度计(WYT-10-32％)测定，悬浮酵母数利用显微镜直接计数法测定。 

结果显示HDY-01酵母、ΔADH I酵母、BADH I-ΔADH I酵母菌15天发酵的过程中，乙醛含量的平均值分别为1.51毫克/升(mg/L)、1.72mg/L和1.51mg/L，说明我们最后构建的低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I与出发工业菌株是一致的。乙醇含量结果显示，三株菌的乙醇平均值分别为0.38(V/V)、0 (V/V)和0.27(V/V)，这表明，低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I的乙醇含量较出发菌株低28％，达到了我们构建低醇啤酒酵母的目的。从双乙酰含量来看，三株菌的双乙酰的平均值为17.41纳克/克(ppb)、20.82(ppb)和8.54(ppb)，低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I的双乙酰含量较出发菌株低了51％。 

生产低醇啤酒的酿酒酵母，菌株大小介于2.0-3.0微米(μm)，圆形。在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)固体培养基表面生长较快，48小时后菌落大小为2.0-3.0毫米(mm)，菌落乳白色，质地均匀，半透明，粘稠，易挑取，有酒香味。 

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的初始阶段包括：设计引物并进行扩增，回收纯化的BADH I基因片段与T-载体pGMT-easy在16℃连接过夜，连接产物pGMT-BADH I转化大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α后，使用Sangon MNIQ-200质粒大量抽提试剂盒SK241提取重组质粒DNA，回收。所述的设计引物为：首先进行枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中ADH I基因的克隆(BADHI)包括：根据GeneBank基因文库登陆的枯草芽孢杆菌ADH I基因序列(NC 000964)，设计一对特异性引物，每个引物30个碱基，用于扩增ADH I基因，在上游和下游分别加上酶切工具酶Xba I的识别位点(斜线表示)，BADH上游引物 BADH下游引物 所述的扩增为：用灭菌牙签挑取少许对数生长时期的枯草芽孢杆菌，放入PCR管中，利用PCR程序中的90℃扩增过程扩增2小时，即可将枯草芽孢杆菌细胞破碎，使全基因组DNA游离出来，作为模板。 

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的回收是将PCR产物用上海华舜生物工程有限公司DNA胶回收试剂盒进行回收，回收纯化的BADH I基因片段与T-载体pGMT-easy的16℃连接过夜，连接产物命名为pGMT-BADH I，连接产物pGMT-BADHI转化大肠杆菌E.coli DH5α后，使用Sangon MNIQ-200质粒大量抽提试剂盒(SK241)提取重组质粒DNA，备用。 

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的构建重组质粒pYC6/CT-BADH I过程中为使BADH I基因与表达载体pYC6/CT进行连接，首先通过Xba I单酶切pGMT-BADHI和pYC6/CT，酶切体系如下表：