[发明专利]新序列人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的克隆及其高效表达

说明书

技术领域：

本发明涉及基因工程和生物制药领域，具体而言，特指用拼接PCR的方法克隆了新序 列的人胰岛素样生长因子-I(简称IGF-I)基因，经原核系统高效表达出IGF-I多肽，具有 促进CHO细胞生长的活性。

背景技术：

胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factors，IGFs)是一类非常重要的生长因子，其 化学结构与胰岛素原类似，包括IGF-I和IGF-II两种相关多肽。大量研究证实，二者在组 织细胞的增殖、分化、凋亡、机体的生长发育及肿瘤的发生发展中起着重要的调节作用。 特别是IGF-I可以促进细胞的生长、与许多疾病相关，如与心血管疾病、代谢综合症、糖 尿病、胰岛素拮抗症等的发生都有着密切的关系。

但是由于IGF-I在原核系统中表达量一直较少，甚至不表达，而在真核系统表达时， 往往在N端发生不正确的加工，也不适于应用；另外，IGF-I在真核系统中表达的成本高、 周期长，因此使它的广泛应用受到了严重的限制。

能够大幅度提高IGF-I在原核系统中的表达量对于IGF-I的深入研究及大量生产有着 非常重要的理论价值及实践意义。

发明创造内容：

本发明的目的是根据已知序列克隆IGF-I基因，并根据同义突变的原理，利用大肠杆 菌密码子偏爱性和密码子兼并性的原理，对IGF-I进行人工改造以提高其表达量。

本发明的目的是这样实现的：

在分析了该基因的大肠杆菌稀有密码子以后，运用大肠杆菌密码子使用频率表和密码 子兼并性的原理，在不更改氨基酸的基础上，对克隆到的IGF-I基因序列进行同义突变， 将该基因更改为大肠杆菌偏嗜性的基因，利用人工合成的方法，以最低的成本合成了三条 单链DNA，采用拼接PCR的方法获得该基因的全长；新序列人胰岛素样生长因子-I基因 包括该人胰岛素样生长因子-I氨基酸序列：Gly Pro Glu Thr Leu Trp Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val Trp Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Trp Trp Phe Arg Ser Trp Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Trp Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala，其核苷酸序列为：GGC CCG GAA ACC CTG TGG GGC GCA GAA CTG GTG GAT GCA CTG CAG TTT GTG TGG GGC GAT CGC GGC TTT TAT TTC AAC AAA CCG ACC GGC TAT GGC TCC AGC AGT CGC CGC GCG CCG CAG ACC GGC ATT GTG GAT GAA TGG TGG TTT CGC AGC TGG GAT CTG CGC CGC CTG GAA ATG TAT TGG GCG CCG CTG AAA CCG GCG AAG TCA GCA TAG。

本方案所述的新序列人胰岛素样生长因子-I基因的高效表达方法为，将改造后的基因 克隆到融合表达载体pET32a(+)上，并导入到E.coli BL21中，采用IPTG诱导的方法诱导 该基因的大量表达多肽，表达量可达到35-40％。该多肽进行组氨酸亲和层析纯化、酶切后， 通过培养CHO细胞检测IGF-1多肽的生物活性，证明其具有促进细胞生长的功能。

本发明提供的是人源的IGF-I基因，以NCBI上登录的A29117基因为依据，设计特异 引物将其克隆，并在此基础上对其序列进行改造，成为新序列的人胰岛素样生长因子-I基 因，其核苷酸序列与A29117基因的序列同源性为80.75％，氨基酸序列未改变。