[发明专利]一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法

权利要求书

1.一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法，其特征在于表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行：一、克隆休哈塔假丝酵母菌的XYL1基因；二、克隆质粒pKT0150中的ADHt基因序列；三、克隆质粒pKT0150中的KanR基因；四、回收、纯化步骤一至三制备的基因片段，然后再分别与pGEMT Easy载体在16℃的条件下连接10～12h，得到pGMT-XYL1、pGMT-ADHt和pGMT-KanR；五、构建质粒pADH，以酿酒酵母整合质粒p406ADH1为骨架引入ADHt基因；六、构建质粒pAK，将KanR基因引入质粒pADH中；七、将XYL1基因引入质粒pAK，即得到表达木糖还原酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为5’-ACTTCTAGATACATCCACAATGAGCCC-3’，下游引物序列为5’-TTCGGATCCTCTACGCAAAGAAAGCAG-3’；步骤二中扩增上游引物序列为5’-CGCCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3’，下游引物序列为5’-CTTGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3’；步骤三中扩增上游引物序列为5’-TTCGACGTCTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’，下游引物序列为5’-GCGGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’；步骤五中用限制性内切酶Xho I和Kpn I对质粒p406ADH1和pGMT-ADHt分别进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶进行连接，得到质粒pADH；步骤六中用限制性内切酶Aat II对质粒pGMT-KanR和pADH分别进行单酶切，然后用T4 DNA连接酶进行连接，得到质粒pAK；步骤七中用限制性内切酶Xba I和BamH I对质粒pAK和pGMT-XYL1分别进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶进行连接，即得到表达木糖还原酶基因的质粒。

2.根据权利要求1所述的一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤一中PCR反应体系为10μL，由1μL 10×PCR buffer、0.8μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、1μL浓度为1pmol/μL的上游引物、1μL浓度为1pmol/μL的下游引物、0.8μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、2μL休哈塔假丝酵母菌基因组DNA、0.2μL浓度为5U/mL的Taq酶和余量的重蒸馏水的组成；PCR反应条件：预变性94℃5min，变性94℃1min，退火50℃1min，延伸72℃2min，共30个循环，延伸72℃10min。

3.根据权利要求1所述的一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤二中PCR反应体系为10μL，由1μL 10×PCR buffer、0.8μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、1μL浓度为1pmol/μL的上游引物、1μL浓度为1pmol/μL的下游引物、0.8μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、2μL质粒pKT0150、0.2μL浓度为5U/mL的Taq酶和余量的重蒸馏水的组成；PCR反应条件：预变性94℃2min，变性94℃45s，退火49℃30s，延伸72℃45s，共30个循环，延伸72℃7min。

4.根据权利要求1所述的一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤三中PCR反应体系为10μL，由1μL 10×PCR buffer、0.8μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、1μL浓度为1pmol/μL的上游引物、1μL浓度为1pmol/μL的下游引物、0.8μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、2μL质粒pKT0150、0.2μL浓度为5U/mL的Taq酶和余量的重蒸馏水的组成；PCR反应条件：预变性94℃2min，变性94℃1min，退火45℃1min，延伸72℃2min，共30个循环，延伸72℃7min。

5.根据权利要求1所述的一种表达木糖还原酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤四中的连接产物pGMT-XYL1、pGMT-ADHt和pGMT-KanR转化E.coli DH5α进行保存扩增。