[发明专利]一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种质粒载体的构建方法。

背景技术

现有的酿酒酵母生产乙醇均是以己糖为原料，由于酿酒酵母缺乏代谢木糖的两种关键酶——木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)，所以不能使木糖代谢后产生乙醇。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前酿酒酵母缺乏木糖醇脱氢酶(XDH)，而不能使木糖代谢后产生乙醇问题，而提供的一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法。

本发明表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行：一、以休哈塔假丝酵母基因组为模板克隆xyl2基因；二、回收、纯化xyl2基因片段后与pGMT vector载体在16℃的条件下连接10～12h，得到pGMT-xyl2；三、重组质粒p406ADH1-1的构建，克隆质粒pKT0150中的ADHt基因序列，然后以酿酒酵母整合载体p406ADH1为骨架引入ADHt基因；四、重组质粒p406ADH1-2的构建，克隆质粒pKT0150中的KanR基因，再将KanR基因加入质粒p406ADH1-1；五、重组质粒p406ADH1-3的构建，克隆酿酒酵母中的rDNA基因，再将rDNA基因加入质粒p406ADH1-2；六、将xyl2基因加入质粒p406ADH1-3，即得到表达木糖醇脱氢酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为5’-TGTTCTAGAATGACTGCWAACCCWTCMTTRGT-3’，下游引物序列为5’-TATCTCGAGYTAYTCWGGRCCRTCAATKARAC-3’；步骤三中ADHt基因序列扩增上游引物序列为5’-AATCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3’，下游引物序列为5’-TATGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3’；步骤四中KanR基因扩增上游引物序列为5’-TTAGGTACCTCTGTTTAGCTTGCCT-3’，下游引物序列为5’-TATCATATGTATCATCGATGAATTCG-3’；步骤五中rDNA基因扩增上游引物序列为5’-CTGCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCTT-3’，下游引物序列为5’-TCACATATGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’。

本发明构建了表达木糖醇脱氢酶基因的质粒，用本发明构建的表达木糖醇脱氢酶基因的质粒转化酿酒酵母工业菌株得到的重组菌HDTG-xyl2能够产生休哈塔假丝酵母中xyl2基因编码的木糖醇脱氢酶(XDH)，其木糖醇脱氢酶活力较出发菌株大大提高，出发菌株不产生木糖醇脱氢酶，重组菌株的木糖醇脱氢酶的酶活为1.51U/mg，酶活力提高，表明构建的表达木糖醇脱氢酶基因的质粒转化酿酒酵母后实现了木糖醇脱氢酶基因的高效稳定表达。对本发明构建了表达木糖醇脱氢酶基因的质粒转化酿酒酵母进行稳定性测定，结果现实60世代后的稳定性为99％，在非选择性压力下，整合于酿酒酵母染色体上的外源基因片断具有良好的遗传稳定性，能适合用于工业生产的粗放环境。

具体实施方式