[发明专利]可溶性猪水疱病VP1抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪水疱病VP1抗原的制备方法，更具体地，涉及可溶性猪水疱病VP1抗原的制备方法。

背景技术

猪水泡病(Swine Vesicular Disease，SVD)是由小RNA病毒科肠道病毒属的猪水泡病病毒(SVDV)引起的猪的一种急性传染病，其临床表现为口鼻腔黏膜和蹄部等出现水泡或溃烂，与猪口蹄疫极其相似，极易误诊，因而其防治引起了人们广泛关注。

目前，我国已经消灭了猪水泡病，因此利用完整病毒粒子建立诊断方法存在潜在的散毒危险，在实践中不可取。

SVDV基因组含有一个大的开放阅读框架，编码一条由2185个氨基酸组成的多聚蛋白，其中编码的结构蛋白为VP4(1A，69aa)、VP2(1B，261aa)、VP3(1C，238aa)和VP1(1D，283aa)；非结构蛋白为2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。SVDV粒子衣壳由4种结构蛋白构成，VP4为内壳蛋白，VP2、VP3和VP1为外壳蛋白。对SVDV结构蛋白的研究发现，病毒的中和性抗原位点在病毒的外壳蛋白上，其中VP3和VP1是诱导中和性抗体产生的主要抗原蛋白。进一步研究证实，VP3和VP1不仅为序列依赖性抗原多肽，而且还具有抗变性作用。有的研究者认为结构蛋白VP1的87、88位残基为一中和性抗原位点；有的认为VP1的1～40位氨基酸残基为一中和性抗原位点；还有人认为VP1的95、98位氨基酸残基为一中和性抗原位点。以上研究成果表明SVDV的抗原中和位点应集中在结构蛋白VP1上。

大肠杆菌是目前应用最为广泛和高效的外源蛋白表达系统，但外源蛋白常以无活性的包涵体形式存在，只有经过变性和复性等过程才能部分恢复重组蛋白的生物学活性，且蛋白的复性效率一般不超过30％，因此限制了重组蛋白在科学研究中的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在大肠杆菌中表达产生生物学活性良好的可溶性VP1蛋白，减少包涵体的形成，避免复杂的变性和复性过程。

为解决上述问题，本发明一方面提供了一种制备可用于检测猪水泡病病毒血清抗体的VP1抗原的方法，所述方法包括以下步骤：(1)克隆VP1基因；(2)构建rVP1；(3)诱导rVP1表达产生可溶性VP1蛋白；和(4)纯化可溶性VP1蛋白。

其中诱导剂为IPTG，其最终浓度为0.05-1.00mmol/mL。优选IPTG的最终浓度为0.1mmol/mL。

其中诱导温度为16-20℃。优选诱导温度为18℃。

本发明另一方面提供了一种制备可用于检测猪水泡病病毒血清抗体的VP1抗原的方法，所述方法包括以下步骤：(1)克隆VP1基因；(2)构建rVP1；(3)低浓度诱导剂和低诱导温度诱导rVP1表达产生可溶性VP1蛋白；和(4)纯化可溶性VP1蛋白。

其中所述诱导剂为IPTG，其最终浓度为0.05-1.00mmol/mL。优选IPTG的最终浓度为0.1mmol/mL。

其中所述诱导温度为16-20℃。优选诱导温度为18℃。

本发明的有益效果在于在大肠杆菌中表达产生了可溶性VP1蛋白，纯化所得VP1蛋白纯度高，免疫学特性与SVDV粒子相似，可替代SVDV粒子作为检测用抗原建立敏感、特异、安全和可靠的SVDV血清抗体的间接ELISA检测方法。

具体实施方式

实验试剂和材料

引物的合成和测序由Takara公司完成，组织总RNA提取试剂盒、扩增用单核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、高保真的Taq酶、限制性核酸内切酶(EcoRHI、XholI)和T4DNA连接酶均购自Takara公司；酶标仪、辣根过氧化物酶标记的兔抗猪和羊抗鼠IgG、底物TMB、诱导剂IPTG、核酸电泳和蛋白电泳所用试剂均购自Sigma公司；Ni-NTA His·Bind Resin层析柱填料、超滤浓缩管和咪唑购自安玛西亚；96孔板和血清管购自深圳金灿华有限公司；紫外分光光度仪、蛋白质电泳仪和酶标仪购自Bio-lab公司。

VP1基因的克隆

VP1基因的克隆按照以下步骤进行：

(1)病毒RNA的提取

参照试剂盒操作提取病毒RNA；

(2)反转录