[发明专利]一种提高蛹虫草液体发酵虫草菌素产量的方法

说明书

蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link]又名北冬虫夏草

技术领域

本发明涉及真菌发酵工程，具体而言涉及蛹虫草液体发酵高产虫草菌素及高含虫草菌素菌丝体的生产方法。

背景技术，隶属于真菌界、子囊菌门、子囊菌纲、粪壳菌亚纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属，又名北虫草，北冬虫夏草。它是虫草属真菌的模式种，蛹虫草含有多种有效成分，包括虫草酸(D-甘露醇)、虫草多糖、虫草菌素(cordycepin)、麦角甾醇过氧化物和虫草环肽等。

人们对蛹虫草的药理作用进行了大量的研究，证实其具有广泛的药理学活性及临床作用。蛹虫草菌粉及胶囊于2003年被批准为国家一类新药(中药)。产品标识其具有补肺益肾、止咳化痰之功效，能够调节机体免疫功能，提高机体综合抗病能力，主要用于慢性支气管炎、各种肿瘤及其它免疫系统疾病的治疗。经大量的研究证明，蛹虫草液体发酵生产的菌丝体与天然冬虫夏草的成份极相似，并证明了它与天然冬虫夏草有相似的药理作用与临床效果，甚至在某些方面优于天然的冬虫夏草(如毒性比天然的小)，可以代替冬虫夏草在临床广泛应用。

虫草菌素即3′-脱氧腺苷(3′-Deoxyadenosine)，又称蛹虫草菌素，由Cunningham等于1951年从蛹虫草的培养滤液中分离得到。虫草菌素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。虫草菌素的分子式为C₁₀H₁₃N₅O₃，分子量251，碱性，针状或片状结晶，熔点230℃～231℃，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，蒽酮反应阳性，紫外光最大吸收波长为259nm。虫草菌素具有多种生物学活性，比如：抑菌作用、抗肿瘤作用、抑制人体免疫缺陷病毒HIVI型病毒的作用、免疫调节作用、减肥和降血糖、降血脂作用。其中，降血脂方面的效果尤为明显，与市售的法国力博福尼制药公司生产的非诺贝特(力平之)效果相当或优于非诺贝特；在治疗白血病方面也在美国由FDA批准进入了临床研究(1997年11月美国癌症研究所，2008年7月美国OncoVista公司)。虫草菌素的结构式为：

近年来，蛹虫草的生产与应用受到了人们的关注，涉及蛹虫草的专利申请近百件。但是决大多数集中在固体培养的研究方面，涉及液体培养的很少，例如200610010482.4号“蛹虫草液体静置培养技术”、200510050531.2号“一种北冬虫夏草液体菌种营养基的制备方法及其应用”、01124109.8“发酵培养生产虫草素的方法”，但以上发明其单位产量很低，最高只有7.1mg/L；03135295.2“一种提高虫草菌素含量的方法”公开了一种提高虫草菌丝中虫草菌素含量的方法，但其采用752型分光光度计的检测方法不当，因最大吸收峰相近，未能将虫草菌素和其他核苷类物质(如腺苷)区分开。故只有通过工艺方法的改进才可克服现有缺点从而高效提高蛹虫草虫草菌素的产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高蛹虫草液体发酵虫草菌素产量的方法，以克服现有技术蛹虫草菌丝体中虫草菌素含量低和发酵液中虫草菌素单位产量低的缺陷。

本发明所使用的菌株为蛹虫草(Cordyceps militaris)无性型蛹草拟青霉(paecilomyces militaris)PM-71菌株，已于2008年4月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCCNo.2459。

发明人经过系统的研究和试验后，提出了通过添加剂提高蛹虫草液体发酵虫草菌素的产量，以及高含虫草菌素蛹虫草菌丝体的生产方法，方法包括：

(1)将菌株转接于斜面培养基上进行培养、活化，得到斜面母种；

(2)将斜面母种制成孢子浓度适中的孢子悬液，接于液体母种培养基中，摇瓶培养，得到液体母种；

(3)在发酵培养基中，加入添加剂腺嘌呤和甘氨酸按照一定比例配成的复合物，高温灭菌后冷却，再将液体母种接入，摇瓶培养，得到含菌丝体(大部分为菌丝球)的发酵液；

(4)通过过滤将菌丝体及发酵液分离，用纯净水冲洗菌丝，洗去培养基后，收集菌丝体，烘至恒重，制得高含虫草菌素的干菌丝体。