[发明专利]家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP30基因

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种来自于家蚕微孢子虫的孢壁蛋白基因SWP30。

背景技术

微孢子虫(Microsporidia)隶属于原生生物界(Protista)、微孢子虫门(Microspora)(Levine and Corliss 1980)，近期研究表明微孢子虫在进化上与真菌有着紧密的亲缘关系。微孢子虫近150个属1300余种，是专营细胞内寄生，具有抗性极强的孢子，通过极管刺入宿主组织细胞后将其孢原质注入细胞，完成感染并大量增殖，最终破坏宿主组织。它能广泛寄生感染无脊椎动物和脊椎动物，尤其是极具经济价值的昆虫、鱼类、啮齿类、兔类、皮毛动物、灵长类以及家庭宠物如狗和鸟，引发疾病甚至死亡。其中家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)，能经食下和胚种途径寄生于家蚕，引发严重的传染性微粒子病，最终导致家蚕大规模死亡，给世界蚕业造成巨大的经济损失，成为近100年来影响蚕业生产的难题。另外新发现，许多属的微孢子虫与人类疾病有关，如角膜病、角膜结膜炎、呼吸疾病、前列腺肥大和扩散感染、肝炎、脑炎、痢疾、肌炎、胆管炎等等，甚至还能机会性地感染艾滋病(AIDS)患者、器官移植病人、服用免疫抑制剂药物病人和先天性免疫机能不健全者，引起呼吸系统、泌尿系统和皮肤溃烂等恶性疾病，加剧病情，加速病人的死亡。

对于微孢子的治疗已有报道，如烟曲霉素及它的衍生物抑制甲硫氨酸氨基肽酶2的活性，阿苯达唑和苯丙咪唑能够抑制微管蛋白形成，它们被鉴定为治疗微孢子的有用药剂，然而，对于治疗感染人类的多种微孢子仍没有找到有效、安全的药物。

微孢子虫能够产生一种感染性的，能够抵制环境的孢子，孢子弹出内部极丝并将其内含物接种到临近宿主细胞。孢子发芽机制一直吸引着微孢子虫研究者们。近年来的研究表明，在微孢子虫受到外界刺激发芽之前，存在一个微孢子虫孢子与宿主细胞相互接触，以提高宿主细胞感染率的过程，而微孢子虫的孢壁蛋白在此过程中起着与宿主细胞相互识别和粘附的作用，如果抑制了微孢子虫孢子与宿主细胞的粘附作用，就可能降低了宿主细胞的感染率甚至控制宿主细胞的感染，因此近年来微孢子虫孢壁蛋白已成为该领域的研究焦点。

发明内容

本发明基于蛋白质组学研究和基因组数据分析，克隆分析和免疫学鉴定家蚕微孢子虫孢壁蛋白蛋白基因SWP30。通过对家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因的克隆，得到了孢壁蛋白SWP30的编码序列，具体方法如下：

(1)引物设计：根据蛋白质组学的方法以及家蚕微孢子虫的6倍基因组数据，获得孢壁蛋白SWP30编码序列，利用引物设计软件Primer 5.0进行引物设计，在正向引物加入BamH I酶切位点，在反向引物加入Xho I酶切位点。引物序列分别为：

SWP30-primer-F：5’GCGGATCCATGAATATTTTACTTGCTAC 3’

SWP30-primer-R：5’CCGCTCGAGGAAAGGAATGGTATTGTC 3’

(2)NbSWP30基因PCR扩增：由于微孢子虫基因组的高度简化特点，内含子很少，基因组序列数据显示SWP30基因不含内含子，故利用提取的微孢子基因组直接作为模板，采用基因组PCR扩增目的片段。SWP30基因长度为834bp；

(3)NbSWP30基因克隆：NbSWP30扩增片段克隆到pMD18-T(TaKaRa)载体上，然后进行序列测定，从而获得NbSWP30的全长编码序列；

(4)序列分析：该序列与本发明申请人2000年登陆NCBI数据库的表面抗原P30.4序列(登陆号：AF245278.1，GI：7542623)相比，本次序列为一完整的基因，增加了5’端66核苷酸，这66核苷酸编码22个氨基酸残基，编码该蛋白的信号肽部分，决定着该蛋白的分泌性表达。