[发明专利]改进的免疫荧光细胞染色方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及改进的免疫荧光细胞染色方法。

背景技术

调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一类具有免疫抑制作用的T细胞，是机体维持自身耐受的重要组成部分，在免疫相关性疾病、肿瘤免疫和器官移植免疫等方面具有重要意义。目前，免疫相关性疾病、肿瘤和器官移植患者外周血Treg细胞表达水平及其临床意义已成为研究的重点。已有研究表明，Treg细胞比例上升可能是导致系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、肺癌、胃癌、卵巢癌、鼻咽癌、乙肝病毒感染等免疫抑制的原因之一；患者治疗前后Treg细胞数量的变化可作为疗效评估的指标之一。传统鉴定Treg细胞主要是通过CD4⁺CD25⁺双阳性来定义，但这种方法并不完全准确，因为CD25分子在部分活化的CD4⁺非Treg细胞上也会表达。研究发现，转录因子Foxp3(forkhead box P3，Scurfin)与Treg细胞的生长发育和功能维持密切相关，在小鼠特异性表达于CD4⁺CD25⁺T细胞；在人类不仅表达于CD4⁺CD25⁺T细胞，还表达于CD8⁺CD28^-T细胞，但在CD4⁺T细胞中的表达明显高于CD8⁺T细胞，是目前公认的Treg细胞的特异、敏感标志。

由此，美国eBioscience公司开发了一套针对Foxp3的免疫荧光细胞染色试剂和方案，用于流式细胞术检测Treg细胞，现已成为Treg细胞染色检测的常规方法，主要包括以下步骤：

a、表面染色：在细胞悬液中，加入细胞表面抗原(如CD4、CD25等)的荧光标记抗体，于温度2-8℃避光孵育20分钟；同时设阴性同型对照；

b、洗涤：在经步骤a表面染色处理后的细胞悬液中，加入预冷的流式细胞术染色液(Flow Cytometry Staining Buffer)或预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)，离心洗涤细胞，弃上清；重复洗涤2次；

c、固定/通透：在经步骤b洗涤处理后的细胞沉淀中，加入固定/通透液(Fixation/Permeabilization)，混匀，于温度2-8℃避光孵育30-60分钟；

d、通透：在经步骤c固定/通透处理后的细胞悬液中，加入通透液(Permeabilization Buffer)，离心洗涤细胞，弃上清；重复洗涤1次；

e、核内染色：在经步骤d通透处理后的细胞沉淀中，加入Foxp3荧光标记抗体，混匀，于温度2-8℃避光孵育至少30分钟；同时设阴性同型对照；

f、洗涤：在经步骤e核内染色处理后的细胞悬液中，加入通透液，离心洗涤细胞，弃上清；重复洗涤1次；

g、重悬：在经步骤f洗涤处理后的细胞沉淀中，加入流式细胞术染色液，重悬细胞。

此方法为二步多重染色法，先进行细胞表面抗原染色，再进行细胞核内抗原染色，具有良好的染色效果，能够准确地识别Treg细胞，但存在操作较繁琐、耗时、且成本较高的缺点。因此，需要对此方法进行改进和优化，既能够保持良好的细胞染色效果，又可以简化操作、缩短时间、节省试剂、降低成本。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种改进的免疫荧光细胞染色方法，可以同时对细胞表面抗原和核内抗原进行多重染色，具有良好的染色效果，且方法简便、快速、经济。

本发明的改进的免疫荧光细胞染色方法，包括以下步骤：

a、固定/通透：在分离的细胞沉淀中，加入固定/通透液，混匀，于温度2-8℃避光孵育30-60分钟；

b、通透：在经步骤a固定/通透处理后的细胞悬液中，加入通透液，离心洗涤细胞，弃上清；

c、表面染色和核内染色：在经步骤b通透处理后的细胞沉淀中，加入细胞表面抗原的荧光标记抗体和核内抗原的荧光标记抗体，于温度2-8℃避光孵育至少30分钟；同时设阴性同型对照；

d、洗涤：在经步骤c染色处理后的细胞悬液中，加入通透液，离心洗涤细胞，弃上清；

e、重悬：在经步骤d洗涤处理后的细胞沉淀中，加入流式细胞术染色液，重悬细胞。

进一步，所述步骤c细胞表面抗原的荧光标记抗体选自荧光标记的抗CD4抗体或抗CD25抗体，或用不同颜色荧光标记的抗CD4抗体和抗CD25抗体；

进一步，所述步骤c细胞核内抗原的荧光标记抗体选自荧光标记的抗Foxp3抗体；