[发明专利]用于外加直流电场下观察细胞生物学行为的装置

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及一种用于外加直流电场下观察细 胞生物学行为的装置。

背景技术

直流电场(direct-current electric fields，dcEF)在生物体中广泛存 在，是由于多种带电离子(如Na⁺、K⁺、Ca²⁺、HCO₃^-、Cl^-等)在细胞内外、细 胞与细胞之间、组织和器官不同部位分布的差异而产生的。近年来，人们对 直流电场的生物效应的研究逐渐深入，涉及胚胎发育中组织形成、炎症反应 以及损伤修复等细胞生物学各个领域，已经证实多种细胞的运动、分裂，如 胚胎发育中神经细胞的迁移、肿瘤细胞的侵袭与转移等，受到直流电场的影 响；应用外加直流电场刺激，可引导轴突再生治疗难治性脊髓损伤修复，或 调节皮肤伤口愈合等。直流电场的生物效应研究正日益受到人们的重视，其 研究意义重大，目前尚处于起步阶段，主要是在细胞水平上对直流电场下细 胞的生物学行为进行研究。此项研究需要一种制作简便、性能稳定、重复性 好、可用于实时动态观察的装置，能够产生稳定的生理强度的电场，长时间 作用于培养的细胞，并能在显微镜下观察细胞活动情况。

此种装置目前较成熟的是文献报道的Min Zhao等制作的装置(Nature Protocols，2(6)：1479-1489，2007；Nature，442：457-460，2006)，即 先制作一个方形的玻璃井；再在细胞培养皿底部并排粘上两块盖玻片，两块 盖玻片之间留出一定距离形成通道，用3140硅胶在培养皿底部沿两块盖玻片 的上缘和下缘(通道部分截断)分别筑二道隔离堤，使电流仅从通道通过； 然后将玻璃井置于通道中，井内加入细胞悬液，待细胞在通道底部贴壁生长 后移除玻璃井，在通道顶部、于两块盖玻片之间粘上盖玻片，形成电流通过 空间；再在培养皿中加入培养基；最后盖上培养皿盖，接上琼脂胶盐桥、银- 氯化银电极及电源，置显微镜下进行观察。但该装置存在以下缺陷：(1)制 作复杂、耗时且不能重复使用；(2)每次制作的装置之间可能存在误差而影 响实验结果的精确性；(3)每次制作时需粘贴盖玻片和涂胶，易破坏细胞培 养部位的无菌状态，且硅胶在完全干燥前可能释放某些化学物质至培养基中 而导致培养基的污染；(4)通道顶部粘贴的盖玻片的高度难以阻挡培养基漫 过，当加入培养基过多或移动培养皿时培养基易漫过盖玻片而影响观察；(5) 对观察的细胞难以定位，无法将某细胞的生物学行为观察结果与后续的分子 生物学或细胞生物学检测结果相对照；(6)难以实现同等条件下两种细胞的 直观比较；现有技术中，比较两种细胞多采用分别观察，再将数据进行统计 学处理的方法，其缺点在于无法保证每次实验条件完全一致；也可采用对其 中一种细胞进行荧光标记，然后在同一细胞爬片上同时观察两种细胞的方法， 其缺点在于需将能够表达荧光蛋白的载体转染入细胞，成本昂贵，操作复杂， 对转染效率要求高，在不能100％表达荧光蛋白的情况下，很难对两种细胞各 自的生物行为学进行准确的判断；还可采用在同一爬片上筑隔离堤，在隔离 堤两边分别培养两种细胞的方法，其缺点在于培养细胞时两种细胞极易混合， 且隔离堤往往不能做得足够薄，难以达到在同一显微镜视野下观察两种细胞 的目的；(7)不能实时监测或控制通过细胞的直流电场的强度，并通过监测 随时对电源输出的电压进行调整；(8)不能序贯性观察不同电场方向对细胞 的影响。

唐波等在Min Zhao等的基础上制作了一种改进装置(第三军医大学学报， 27(7)：683-684，2005)，包括直流电源、电极系统、观测小室和细胞培养 室。其改进点主要在于：先在盖玻片上培养细胞，再将制好的细胞爬片放入 载玻片上的“U”型槽中，在“U”型槽顶部粘贴载玻片，形成观测小室；然 后将观测小室粘贴至一个由有机玻璃制成的方形小室的底板正中，制成细胞 培养室；细胞培养室顶盖上位于观测小室上方设置两孔，用于实验中测量电 压。这些改进仅克服了Min Zhao等制作装置的部分不足，仍然存在制作较复 杂，制作过程易导致污染，培养基易漫过盖玻片，对观察的细胞难以定位， 难以实现同等条件下两种细胞的直观比较，不能序贯性观察不同电场方向对 细胞的影响等缺陷，且有机玻璃制成的细胞培养室不能应用常规的高压消毒。

发明内容