[发明专利]一种蛇毒抗肿瘤的细胞毒素及其生产工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生化与生物医药领域，具体的说是一种蛇毒细胞毒素及其生产工艺。

背景技术

细胞毒素的分离纯化最早是在1947年由印度学者用盐析法(Na₂SO₄和NaCl)从印度眼镜蛇毒中分离得到的；接着Ravdonat and Holler用纸层析法；Braganca等经CM-cellulose离子交换层析、Sephadex G-50凝胶过滤等步骤分离出CytotoxinP₆；杜雨苍等用SP-Sephadex C-25阳离子交换层析从中华眼镜蛇毒中分离出5个细胞毒素。但随着对细胞毒素研究的深入，许多学者注意到采用传统的分离方法会出现痕量的磷脂酶A₂(PLA₂)(0.1～0.5％，w/w)与CTX共同洗脱下来，而PLA₂与CTX会产生协同作用，可使CTX的溶血作用显著增强，也可使它的细胞毒性增加数倍，严重干扰了对CTX的生物学活性及其作用机制的研究，因此分离得到不含PLA₂的CTX很重要。Hodges等介绍了一种新的从眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素同系物的方法：(1)粗毒过Sephadex G-50凝胶过滤柱去除大分子杂蛋白，得主要毒素峰；(2)主峰过SP-Sephadex C-25阳离子交换层析，线性梯度洗脱得一系列蛋白峰；(3)主峰再过反相高效液相(RP-HPLC)。这种方法对去除痕量磷脂酶A₂很有效，同时也保留了CTX的全部生物学活性。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤作用的蛇毒细胞毒素纯品及其生产工艺。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种具有抗肿瘤作用的蛇毒细胞毒素，其特征是：取之于现有眼镜蛇毒冻干粉。

所述的眼镜蛇毒冻干粉是未经双蒸水溶解的。

一种具有抗肿瘤作用的蛇毒细胞毒素生产工艺，其特征是：

1)去杂质的眼镜蛇毒冻干粉未经适量的双蒸水溶解后，上SP Sepharose HighPerformance阳离子交换柱层析，得20个蛋白峰(I-XX)，收集具有细胞毒素活性的XII、XIII峰。

2)收集具有细胞毒素活性的XII、XIII峰分别上经Source 30RPC反相层析，分别得到主蛋白峰一个，即细胞毒素XII和细胞毒素XIII。

所述的SP Sepharose High Performance(GE Healthcare公司产品)。

所述的Source 30RPC(GE Healthcare公司产品)。

本发明的有益效果是：本发明的生产工艺第1步骤与现有技术不同的是选用高分辨率快速阳离子交换介质SP Sepharose H.P，在蛋白纯化系统进行分离纯化，因而获得高分辨率的分离效果，故可获得20个蛋白峰，而使用现有技术工艺最多获得15个蛋白峰；在蛋白纯化系统用SPSepharose H.P分离蛋白质不仅分辨率极高，而且有良好的重复性和工艺放大能力。本发明的第2步骤选用高速低反压高分辨率Source 30RPC介质，获得高分辨率精细纯化效果，第1步骤获得的细胞毒素组分经第2步纯化即获得不含PLA₂的细胞毒素纯品，比现有技术纯化步骤具有快速重复性好，适合放大生产。

附图说明

以下结合附图和实施例对本发明进行详细说明：

图1为蛇毒经SP-Sepharose H.P阳离子交换柱层析图谱。

图中眼镜蛇毒粗毒经SP-Sepharose H.P阳离子交换色谱分离得到20个蛋白峰，分别记为I、II、III、IV、V、VI、IVI、VII I、IX、X、XI、XI I、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVII、XIX和XX。测定各洗脱峰对大鼠离体心脏和离体隔神经隔肌标本的影响的影响，发现组分XI、XII、XIII和XIV具有抑制心脏收缩幅度，使心脏停于收缩期，能抑制直接刺激膈肌引起的收缩，初步鉴定为细胞毒素组分。

图2和图3为具有细胞毒活性蛋白峰经Source30 RPC反向层析图谱。

将XII、XIII用Source30 RPC柱进一步纯化，各得到主蛋白峰1个，分别记为CTX-XII和CTX-XIII。经鉴定他们均具有杀伤肿瘤细胞作用。

其中：图2为Source 30RPC反相层析纯化CTX-XII；

图3为Source 30RPC反相层析纯化CTX-XIII。