[发明专利]一种灵芝杂交育种方法

权利要求书

1.一种灵芝杂交育种方法，包括灵芝亲本菌株选择、菌丝培养、再生培养基配制、菌丝裂解、单细胞再生、单核细胞分离、单核体杂交，杂交菌株培养并筛选，其特征在于

(1)灵芝亲本菌株选择：取广东赤芝和灵芝5.75为杂交亲本，转接到PDA斜面中进行活化两次；

(2)把经2次活化好的菌种接种至PDA培养基中，放置摇床中培养7天，培养温度为25度，转速为100转每分钟；PDA培养基由市场购得；

(3)再生培养基配制：葡萄糖10.0g·L^-1、麦芽糖5.0g·L^-1、酵母膏5.0g·L^-1、氯化钾44.73g·L^-1、固化培养基添加琼脂20g·L^-1；

(4)菌丝裂解，是将经过2次活化、处于生长对数期中期的亲本液体菌丝分别放入离心管中，离心后取沉淀，并加入无菌水清除菌丝外壁的杂质，再用稳渗液清洗，将清洗后的菌丝悬浮于溶壁酶液，于30℃的循环水浴锅中恒温水浴至单细胞完全释放，得单细胞裂解液；

(5)单细胞再生，即离心单细胞裂解液，取沉淀，并用再生培养基清洗沉淀至单细胞外不含溶壁酶，然后用再生培养基稀释至单细胞浓度为2～3个/低倍镜视野，将单细胞稀释液涂布至再生培养基平板中，并倒置培养皿于25℃培养箱中培养，至单细胞开始萌发；

(6)单核细胞分离，是从单细胞萌发的培养皿中挑取单个已长出芽管的单细胞连同培养基放入斜面培养基中，于25℃培养，长出3～5cm的菌落时，镜检挑取无锁状联合的菌株；

(7)单核体杂交：将20mlCM培养基装入干净的培养皿中，两个配对菌株相距1cm接种，25℃下培养7天，当两个菌株的菌落相互接触后，挑取交接处的菌丝；

(8)杂交菌株培养并筛选：常规方法培养所获得的杂交菌株，并从中筛选出杂种优势强、相对性状优良的杂交菌株。

2.根据权利要求1所述的一种灵芝杂交育种方法，其特征在于菌丝裂解的具体步骤如下：

(1)把在PDA培养基中已经长成的菌丝移入7ml的离心管中，每管5ml，赤芝与灵芝5.75各两管；

(2)将步骤(1)移好菌液的离心管放入高速离心机中10000rpm离心10min；

(3)将步骤(2)离心过的离心管取出，倒出上清液，加入无菌水，振荡后再次放入高速离心机中以10000rpm离心10min；

(4)将步骤(3)离心过的离心管取出，倒出上清液，加入稳渗液洗涤，振荡后再次放入高速离心机中离心；

(5)将步骤(4)离心过的离心管取出，用无菌滤纸过滤去溶液后，将收集的菌丝在无菌滤纸上吸干水份，称取0.5g菌丝，放入干净的离心管中；

(6)称取100mg溶壁酶加入另一个干净的离心管，加入5ml稳渗液，制得溶壁酶液；

(7)向步骤(5)放入菌丝的离心管中加入2.5ml溶壁酶液，振荡；

(8)把步骤(7)加入溶壁酶液的离心管放入循环水浴器中30℃水浴2.5～3.0h，其间5～10分钟振荡一次，至单细胞完全释放，得单细胞裂解液；具体方法：从离心管中取少量溶液，用血球计数板在显微镜下检查单细胞数量，至确定单细胞完全释放。

3.根据权利要求1所述的一种灵芝杂交育种方法，其特征在于单细胞再生的具体步骤如下：

(1)将装有单细胞裂解液的离心管放入离心机中，于4℃，1000rpm离心20min；

(2)将离心过的离心管取出，倒去上清液，取沉淀，各加入2ml稳渗液洗涤后再放入离心机以4℃，1000rpm离心20min；

(3)将步骤(2)离心过的离心管取出，倒去上清液，取沉淀，各加入2ml再生培养基，放入离心机，于4℃，1000rpm离心20min；

(4)将步骤(3)离心过的离心管取出，倒去上清液，加入再生培养基稀释，稀释后各取一小滴溶液于载玻片上，盖上盖玻片后放上显微镜观察，使单细胞浓度为2～3个/低倍镜视野；

(5)将稀释后的单细胞液涂平板，每皿涂布0.5ml，倒置平板培养皿于25℃下培养48小时，单细胞开始萌发。

4.根据权利要求1所述的一种灵芝杂交育种方法，其特征在于单核细胞分离的具体步骤如下：

(1)将平板培养皿放于显微镜下寻找已萌发并长出芽管的单细胞，且周围其他部分无相同菌丝；

(2)点燃酒精灯，将接种针于酒精灯上烧红，在显微镜下挑取单个已萌发并长出芽管的单细胞连同一小块培养基的，并确保培养基上无其他单细胞；

(3)在火焰处拔出斜面培养基上的硅胶塞，将挑出的培养基块放入，塞回硅胶塞，放于25℃下培养让其生长；

(4)当长出3～5cm的菌落时，无菌操作挑取少量菌丝，显微镜下检查是否有锁状联合，挑取无锁状联合的菌株。