[发明专利]一种抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗白色念珠菌抗菌肽的制取方法，尤其是一种抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法。

背景技术

抗菌肽（antibacterial peptides，ABP）是由生物体基因编码、相对分子质量小，具有抗菌活性的肽类物质的总称。它是宿主产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子多肽，广泛存在于昆虫、植物、动物和人体内，除有抗细菌、真菌和病毒等病原体作用外，还具有抗肿瘤细胞作用。因此，抗菌肽又称为肽抗生素（peptide antibiotics）。它是机体非特异性免疫的重要组成部分，是生物体抗感染免疫的古老机制，所以又叫做"第二防御体系"。研究表明，抗菌肽具有抗菌活性强、广谱抗菌、热稳定性及不易产生耐药性等优点。同时还有高效的抗真菌和(或)抗病毒和(或)原虫和(或)抗肿瘤活性。在临床感染菌对传统抗生素耐药性日益严重的今天，人们希望抗菌肽成为继传统抗生素之后的又一类新型抗感染药物。随着分子生物学技术的发展，抗菌肽已成为近年来分子免疫学和分子生物学的研究热点。研究的内容包括：抗菌肽的分离与纯化，氨基酸序列的分析；蛋白质构型与功能的关系，抗菌肽的作用机理；应用基因工程技术克隆和表达抗菌肽基因；改造合成抗菌肽基因以及动植物的转抗菌肽基因工程等。

近年来，随着抗生素的应用和滥用，耐药菌株不断增加，向抗感染治疗提出了严峻的挑战。根据美国《新闻周刊》报道，早在1992年全美国就有13300名患者死于抗生素耐药性细菌感染。现在已有抗所有抗生素的耐药菌株出现。为了解决这一问题，人们一方面对传统抗生素进行结构改造以对付细菌的耐药性，另一方面，人们研究和开发新型的药物。抗菌肽与传统抗生素相比，其不同点在于抗菌肽的作用靶位点是病原体细胞膜，因此不易产生耐药性，尤其是抗菌肽能特异性的抑制肿瘤细胞，而对正常细胞没有毒害作用，这给抗癌药物的开发带来了新的希望。美国、英国皇家医学会将抗菌肽列为21世纪抗癌首选药物。另外，抗真菌肽的发现，对人们棘手的真菌病治疗提供了新的思路。

目前，许多抗菌肽都被开发成药物，但天然抗菌肽的产量非常有限，合成肽价格非常昂贵，这将成为开发新药的一个瓶颈。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法。

本发明的特征在于由以下方法来实现；

一、样品处理：

将100-200g绵羊生殖道剪碎成0.5-1.2cm2的小块，9000-12000r/min离心5-20min，零下10-20℃冻融3-4次，用超声波细胞破碎仪破碎细胞，按1:1.5-3体比加入浓度为5-30%乙酸，在3-5℃搅拌浸提20-26h，然后在3-5℃时，将浸提混合物在高速冷冻离心机上用10000-15000r/min离心20-30min，收集上清透析，测定蛋白浓度，冷冻干燥，零下10-20℃低温保存，取0.1-1mg重新溶解在浓度为0.01-0.05%乙酸中用于检测活性；(本文中涉及的百分比浓度，除另加说明外均指体积百分比)

二、抗菌肽初级分离；

用凝胶过滤色谱方法进行初级分离：在室温下将48-53.0g交联葡聚糖凝胶G-50(SephadexG-50)，溶解于480.0-530.0mL去离子水中膨胀20-26h，采用真空泵脱除凝胶中气体后，进行装柱使其成φ1cm×15-100cm柱，先用0.15-0.25N氢氧化钠清洗液冲洗2-4h，再用浓度为0.1-0.05mol/L，pH值为5-7乙酸铵洗脱液平衡柱子，将样品重悬在上述洗脱液中，以9000-12000r/min离心10-20min，取上清上样，洗脱流速18-20mL/h，收集目的峰，整个洗脱过程在0-10℃环境中进行，用吸光值200-300nm检测洗脱峰，收集后冷冻干燥，重新溶解在浓度为0.01-0.05%乙酸中，测定蛋白浓度、检测抗菌活性；

三、抗菌肽的精分离：

用反相高效液相色谱方法进行精分离：将凝胶过滤色谱有抗菌部分进行第二步分离纯化，将样品重悬在浓度为0.01-0.05％乙酸洗脱液中，在0-10℃时以9000-12000r/min离心10-20min，取上清上样于反相高效液相色谱柱(HypersilBDSC18RP-HPLCcolumn)，柱长为20-100cm，用含浓度为0.08-0.11％三氟乙酸的水和含浓度为0.08-0.11％三氟乙酸的乙腈按990-999:1-10的体积比构成的洗脱液进行梯度洗脱，吸光值200-300nm检测洗脱峰，收集冷冻干燥，测定蛋白浓度、检测抗菌活性；