[发明专利]可溶性淀粉共振散射光谱法检测α－淀粉酶活力的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及α-淀粉酶活力的检测方法，具体是可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法。 

背景技术：

α-淀粉酶(α-Amylase，AMS)的全称为1，4-α-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.1)，是一种不均一性的钙依赖金属蛋白质酶，它作用于淀粉的α-1，4葡萄糖苷键，生成麦芽糖和葡萄糖。它已经广泛用于食品、发酵、谷物加工、纺织、造纸、医药、轻化工业、石油开采等各个领域。在临床上有很高的应用价值，根据体内酶活力的变化诊断疾病，如胰脏疾病和肾脏疾病导致淀粉酶活力升高；肝脏疾病可导致酶活力下降。因此对α-淀粉酶的研究具有重要的意义。目前对于α-淀粉酶的检测，有流动注射光度法、微量量热法、粘度测定法、碘量法、凝胶扩散法3.5二硝基水杨酸法等。其中流动注射光度法的线性范围为0.1-3mmol·L^-1，灵敏度较低。粘度测定法因精确性差，底物不稳定很少采用。微量量热法虽然相对较简单，但不够准确。检测α-淀粉酶活力的方法虽然很多，但可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法，尚未见报道。 

发明内容：

本发明的目的是要公开一种灵敏度高，简便快速的可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法。 

溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法包括如下步骤： 

一、制备已知α-淀粉酶活力的测试体系： 

1、在5mL具塞刻度试管中，分别加入0.65ml 10mg/mL可溶性淀粉和pH 5.3Na₂HPO₄-KH₂PO₄溶液，然后再加入0.10mL 0.2％CaAc₂溶液和0.1ml 0.9％Nacl溶液，将试管置水浴锅中，50℃预热，放置5min； 

2、然后再加入5uL-300uL浓度为5μg/mL α-淀粉酶溶液，摇匀时开始计时，放回50℃水浴锅中温浴，放置85min； 

3、然后再依次加入0.40mol/L 0.2ml NaOH溶液，用二次蒸馏水定容至3ml，摇匀。 

4、用荧光光度计同步扫描得到体系的共振散射光谱，淀粉微粒在264nm和423nm处有两个较宽的散射峰，在423nm处测定体系的共振散射强度I_423nm； 

二、制备试剂空白体系： 

用步骤一的方法制备试剂空白体系，但不加入α-淀粉酶溶液，用荧光分光光度计测得试剂空白体系共振散射强度I₀； 

三、计算ΔI_423nm＝I₀-I_423nm的值； 

四、以加入的α-淀粉酶浓度为横坐标，以ΔI_423nm为纵坐标，绘制工作曲线； 

五、依据步骤一的方法，制备检测体系，加入的α-淀粉酶为未知浓度的检测样品，求得 被测样品的ΔI； 

六、根据工作曲线，求得被测样品中α-淀粉酶的浓度。 

实验表明，在未加入α-淀粉酶之前，可溶性淀粉体系的同步散射光谱较强(图1)，当有α-淀粉酶存在时，体系的同步散射有所减弱，随着浓度的增加，共振散射强度也逐渐降低，并且，α-淀粉酶的浓度在0.00835-0.501μg/ml范围内，α-淀粉酶的浓度与共振散射强度呈良好的线性关系，线性方程为ΔI＝155C+13。检测限为0.0069μg/ml。 

本发明的原理： 

可溶性淀粉具有很强共振散射效应，α-淀粉酶水解可溶性淀粉成小颗粒的淀粉微粒，共振散射强度降低。共振散射强度降低的大小与α-淀粉酶的浓度呈正比关系，将可溶性淀粉微粒的共振散射光谱检测与α-淀粉酶的催化反应相结合，建立起可溶性淀粉共振散射光谱法检测α-淀粉酶活力的方法。 

本发明的优点： 

(1)设备简单、操作方便，只需要荧光分光光度计即可完成； 

(2)试剂易得，成本低廉； 

(3)底物可溶性淀粉无毒。 

附图说明：

图1为本发明实施过可溶性淀粉体系的共振散射光谱图；