[发明专利]灰斑蛤蚧和红斑蛤蚧的微卫星标记技术

说明书

技术领域

本发明属于动物中药材分子生物学技术领域，具体涉及一种灰斑蛤蚧和红斑蛤蚧的微卫星标记技术。

背景技术

品种鉴定传统上主要采用性状鉴别、显微鉴别、同工酶电泳等方法来鉴别品种(品系)的真伪和纯度，这些方法都不同程度地存在缺陷，难以满足商业化的技术需求。微卫星标记技术可以弥补传统方法的缺陷，微卫星是指以几个(1-6bp)核苷酸为单位，多次串联重复序列，也称之为简单重复序列(singlesequence repeats，SSR)、短串联重复序列(short tande m repeats，STR)或简单序列长度多态性(single sequence length polymorphism，SSLP)，广泛分布于真核生物基因组中，大约每隔10-50bp就有一个微卫星，由于重复次数和重复程度的不完全而造成每一个位点的多态性，利用微卫星标记可以绘制品种(品系)的指纹图谱，指纹图谱是鉴别品种(品系)的有力工具，它具有迅速、准确、可靠等优点，在监测良种质量(真伪、纯度)，防止伪劣品种流入市场，保护我国名、优、特种质的知识产权和育种家们的权益等方面具有重要意义。蛤蚧(Gekko gecko)别名大壁虎、仙蟾、蛤蟹，陆栖的爬行动物。体背有灰色斑点的为灰斑蛤蚧，蛤蚧习居于山岩或树洞内或居住在天花板墙壁上，主要分布于广西、广东、云南等地。蛤蚧可作为药材，具有补肺肾，益精血，止咳定喘功用，有增强免疫力，延缓衰老，抗炎作用，主治虚劳咳嗽、气喘、咯血、消渴等症。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可靠的品种鉴定技术方法灰斑蛤蚧和红斑蛤蚧的微卫星标记技术。这种灰斑蛤蚧和红斑蛤蚧的微卫星标记技术其技术步骤包括蛤蚧微卫星序列的获得、微卫星引物设计、PCR扩增和扩增产物进行检测；蛤蚧微卫星序列的获得包括构建基因组文库(300—800bp)，根据欲得到的蛤蚧SSR类型设计合成寡核苷酸探针，通过菌落原位杂交筛选所需的重组克隆对阳性克隆进行顺序鉴定；对具高度专一性微卫星两侧序列进行蛤蚧微卫星引物设计，扩增同一种蛤蚧甚至不同种蛤蚧的其它基因型片段，微卫星引物在基因组中每一条引物长18-24bp；PCR扩增用的蛤蚧模板包括从蛤蚧全身所有皮肤、组织、器官、血液之一为对象而抽提而来的核基因组DNA或mtDNA中的同源片断，以其为模板，用合成引物进行PCR扩增，扩增时需掺入同位素或其它在效果上可替代放射性物质的标记，对扩增产物进行分析；对扩增产物进行检测包括扩增产物经变性(非变性)聚丙烯酰胺凝胶(0.5—12％浓度)电泳，凝胶干燥后通过放射性自显影显示结果，根据胶片上的条带分布，分析样本多样性，同时包括用银染来检测扩增产物。本发明具有如下有益效果：利用微卫星标记技术鉴别品种(品系)具有迅速、准确、可靠等优点，在监测良种质量真伪和纯度，防止伪劣品种流入市场，保护品种方面具有积极意义。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。

灰斑蛤蚧和红斑蛤蚧的微卫星标记技术发明其步骤包括：蛤蚧微卫星序列的获得、微卫星引物设计、PCR扩增、扩增产物进行检测，其结果可用于构建蛤蚧遗传图谱、蛤蚧遗传疾病诊断、蛤蚧群体(个体)位点多态性的检测、检测品种间亲缘关系、标记辅助选择、蛤蚧种群动态和进化历史揭示等。蛤蚧微卫星序列的获得:包括构建基因组文库(300—800bp)，根据欲得到的蛤蚧SSR类型，设计合成寡核苷酸探针，通过菌落原位杂交筛选所需的重组克隆，对阳性克隆进行顺序鉴定。蛤蚧微卫星引物设计:由于微卫星两侧序列具高度专一性，因此据此设计引物用以扩增同一种蛤蚧甚至不同种蛤蚧的其它基因型片段。微卫星引物在基因组中具有高度专一性，每一条引物长18-24bp，(G+C)百分含量接近50％(Tm60℃左右)。PCR扩增的模板及扩增:PCR扩增用的蛤蚧模板包括从蛤蚧全身所有皮肤、组织、器官、血液之一为对象而抽提而来的核基因组DNA或mtDNA中的同源片断，以其为模板，用合成引物进行PCR扩增，扩增时需掺入同位素或其它在效果上可替代放射性物质的标记，以便对扩增产物进行分析。对扩增产物进行检测:扩增产物经变性(非变性)聚丙烯酰胺凝胶(0.5-12％浓度)电泳，凝胶干燥后通过放射性自显影显示结果，根据胶片上的条带分布，分析样本多样性，同时包括用银染来检测扩增产物，不会降低灵敏度。微卫星位点可经PCR扩增，具高质量信息，是共显性标记物。