[发明专利]一种利用反胶团法分离纯化鱼精蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物活性物质分离纯化技术领域，特别涉及利用反胶团法萃取技术直接从鱼精蛋白粗提液中分离纯化鱼精蛋白的方法。

背景技术

鱼精蛋白是一类从鱼类的鱼白组织中提取的碱性蛋白质。在鱼白中，鱼精蛋白是与DNA以2∶1的比例结合在一起的。鱼精蛋白是一种小而简单的球形碱性蛋白，一般由30～50个氨基酸组成，分子量比较小，一般在6000～10000道尔顿左右。其氨基酸组成上的最大特点就是碱性氨基酸占有较大比例，因此其碱性很强，等电点为：10-12。鱼精蛋白可溶于水和稀酸，可被稀氨水沉淀，加热不凝固，热稳定性较好。

毒理试验证明，鱼精蛋白无毒、弱蓄积性，无染色体畸变作用和基因突变作用，对DNA具有极强的吸附亲和作用。鱼精蛋白可以用作天然食品防腐剂，其特点是在中性和碱性范围抑菌能力强，抑菌范围广，热稳定性好，而且卫生安全，没有毒副作用。同时鱼精蛋白具有很重要的医学价值。临床上鱼精蛋白广泛用于抗肝素钠过量，起抗凝血作用，目前在心内直视手术中鱼精蛋白是唯一普遍用于拮抗肝素钠的药物。另外，鱼精蛋白可作为胰岛素、抗菌素、肾上腺皮质激素等药物的载体，延长这些药物在体内的半衰期。一名需每日注射3次胰岛素的病人，若使用鱼精蛋白与锌制成的鱼精蛋白锌胰岛素注射液，可使胰岛素的注射时间间隔延长为每24～48小时给药1次。在利用Vero细胞生产各种疫苗如乙脑、狂犬病、脊髓灰质炎等的过程中，硫酸鱼精蛋白被广泛用作去除疫苗中Vero细胞的DNA的工具试剂。

鱼精蛋白的提取无论是过去还是现在的办法，基本上是以硫酸或盐酸为主要提取剂，以柠檬酸盐或有机溶剂为纯化剂。如制备鱼精蛋白盐类，将鱼精蛋白在稀硫酸溶液中处理，抽取出鱼精蛋白及混杂蛋白。然后在抽提液中加入甲醇或乙醇等有机溶剂沉淀上述蛋白，分离干燥的固体溶于温水中，再冷却析出鱼精蛋白。也有在硫酸或盐酸抽提液中不用有机溶剂而用聚磷酸盐，使鱼精蛋白以磷酸盐形式沉淀出来，然后溶解在高浓度的硫酸铵中，复分解为鱼精蛋白硫酸盐。还有以鱿鱼鱼白为原料，用硫酸酸解、氯化钠抽提，乙醇沉淀成功地提取获得了鱿鱼鱼精蛋白。还有资料报道鱼精蛋白的提取方法是将鱼精蛋白加入NaCl溶液中捣碎离心，收集沉淀，加入HCl溶液捣碎，静置，离心，取上清液。滴加苦味酸，直至沉淀完全，离心，取出沉淀，溶于丙酮中，滴加硫酸使pH至1.8。往溶液中加入等体积的冷丙酮，静置或离心，得沉淀，真空干燥，即为鱼精蛋白盐。

但是，通过上述鱼精蛋白的提取方法得到的鱼精蛋白实际是鱼精蛋白的粗品，还含有其他物质，如核酸、杂蛋白等，需要进一步纯化。一般采用葡聚糖凝胶柱层析法纯化。如将Sephadex G-25或Sephadex G-50按常规处理后装柱，然后用0.1M KCl-0.05M Tris洗脱液洗脱，280nm紫外检测，收集活性组分。利用鱼精蛋白的电荷和分子大小，可采用聚丙烯酰胺等电聚焦电泳法对提取的鱼精蛋白粗提物进行纯化，取胶板的碱性端，经扩散洗脱、透析除盐，就可得鱼精蛋白纯品。传统的鱼精蛋白分离纯化工艺复杂，周期长等缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用反胶团法分离纯化鱼精蛋白的方法，从利用鱼白制得的鱼精蛋白粗提液中萃取纯化鱼精蛋白，该方法可解决鱼精蛋白纯化工艺复杂、周期长的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种利用反胶团法分离纯化鱼精蛋白的方法，从利用鱼白制得的鱼精蛋白粗提液中萃取纯化鱼精蛋白，它包括如下步骤：

(1)制备鱼精蛋白粗提液；将鱼白置于组织捣碎机中，加入0.14M NaCl溶液，匀浆破碎组织后，用纱布过滤得浆液。然后进行离心分离，弃上清夜，得沉淀即鱼精蛋白与DNA的复合物DNP，每克DNP加入4ml7.5％的硫酸，搅拌，混合均匀，离心10min，弃沉淀，沉淀中主要为DNA，上清液即为鱼精蛋白粗提液；

这一步酸处理的目的在于使鱼精蛋白与DNA解离，鱼精蛋白在酸性条件

下溶于上清液中，而DNA则在酸性条件下形成沉淀。

(2)制备反胶团溶液，其由表面活性剂、助溶剂、有机溶剂和水构成，各组分重量份配比为，表面活性剂:助溶剂:有机溶剂:水＝(20-100):(0-200):(800-880):(0-10)，其配制步骤为：按上述比例称取各组分并均匀混合，震荡后静置，至完全溶解，混合均匀，制得反胶团溶液；