[发明专利]碱性橙人工抗原合成及抗体制备方法

说明书

技术领域

本发明属于抗原、抗体的制备方法，专用于非食用色素碱性橙特异性识别、及研制碱性橙的速测免疫试剂盒。 

背景技术

碱性橙是一种偶氮类碱性染料，俗名“王金黄”，化学名为2，4二胺基偶氮苯，分子式为C₁₂H₁₂N₄·HCl。主要用于纺织品、皮革制品及木制品的染色。根据美国卫生研究所(NIH)化学品健康与安全数据库资料表明：摄取、吸人以及皮肤接触该物质均会造成急性和慢性的中毒伤害，有确凿的动物实验数据表明，该物质为致癌物。根据《中华人民共和国食品添加剂使用卫生标准》(GB2760)及《中华人民共和国食品卫生法》的相关规定，为禁止用作食品添加剂的化学制品。由于碱性橙比其它水溶性染料如柠檬黄、日落黄等更易于在鲜海鱼和豆制品上染色且不易褪色，因此一些不法商贩用碱性橙对食品进行染色，以次充好，以假乱真，极大危害了消费者的身心健康。 

目前已有的检测方法主要是高效液相色谱法，但是该方法虽然检出限低，但需要消耗大量有机试剂，污染环境，样品前处理程序复杂，且不能满足大批量食品的快速检测。 

酶联免疫技术是二十世纪六十年代发展起来的新技术，现在已广泛应用于快速、微量检测农药残留。该方法可定性定量检测食品中微量残留有害物质，且对仪器要求不高，操作快速简单，无需对样品进行复杂的前处理，灵敏度高，特异性强，适用于大量样本快速检测，但尚未见应用于非食用色素的检测报道，实现酶联免疫检测的关键是合成碱性橙人工抗原和抗体。碱性橙的分子量较小，是只有反应原性而无免疫原性的半抗原，不能直接刺激动物产生抗体，只有和载体蛋白连接后才能转化为既有反应原性又有免疫原性的完全抗原，刺激动物产生抗体，碱性橙本身含有氨基，因此可以以此基团为基础将碱性橙分子和蛋白分子链接起来。 

发明内容

本发明的目的在于以戊二醛为偶联剂，合成了碱性橙人工抗原，并以此为基础制备了碱性橙抗体。 

本发明的整体技术方案是：碱性橙人工抗原合成方法，包括如下工艺步骤： 

A、免疫抗原合成 

取150-250毫克牛血清白蛋白，15-20毫克碱性橙，浓度为50％的戊二醛溶液1-2毫升，分别将其溶于4-6毫升浓度为0.1摩尔/升、pH＝7.4的磷酸缓冲液、0.2-0.3毫升甲醇及1-2毫升浓度为0.1摩尔/升、pH＝7.4的磷酸缓冲液；以戊二醛为偶联剂，将牛血清白蛋白溶液和碱性橙溶液混匀后滴加戊二醛溶液，于室温下放置1小时，在4℃下放置15-20小时，高速离心12-20分钟，上清液转入透析袋，于0.01摩尔/升、pH＝7.4磷酸缓冲液中在4℃透析5-7天，每天更换两次透析液，透析完毕分装成1毫升/管，-20℃冻存保存； 

碱性橙人工抗原的抗体的制备方法是：选健康雄兔，用免疫抗原免疫实验动物，免疫前观察一周，并分别采血制备阴性血清。 

本发明碱性橙人工抗原合成方法，还包括包被抗原的合成步骤B，该步骤的工艺过程如下：

取150-250毫克卵清蛋白，15-20毫克碱性橙，浓度为50％的戊二醛溶液1-2毫升，分别将其溶于4-6毫升浓度为0.1摩尔/升、pH＝7.4的磷酸缓冲液、0.2-0.3毫升甲醇及1-2毫升浓度为0.1摩尔/升、pH＝7.4磷酸缓冲液；以戊二醛为偶联剂，将卵清蛋白溶液和碱性橙溶液混匀后滴加戊二醛溶液，于室温下放置1小时，在4℃下放置15-20小时，高速离心12-20分钟，上清液转入透析袋，于浓度为0.01摩尔/升、pH＝7.4的磷酸缓冲液中4℃透析5-7天，每天更换两次透析液，透析完毕分装，-20℃冻存保存。 

优选的技术方案是所述的步骤A、B中的离心转速为4000转/分钟。 

所述碱性橙人工抗原的抗体制备具体方法是：免疫实验动物是将分装好的免疫抗原用生理盐水稀释成1-2毫克/毫升的浓度，取1-2毫克免疫抗原加1毫升生理盐水，再加等量弗氏完全佐剂混匀为乳化剂，于兔子的背部皮下多点注射进行首免；2周后，取同样量免疫抗原加弗氏不完全佐剂乳化后进行背部皮下多点注射，为加强免疫；采用同样的操作方法重复免疫4次，每次隔2周；在免疫后采血制备抗血清。