[发明专利]PCR－mtDNA检测鹌鹑源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法

说明书

技术领域：

本发明主要涉及禽类源性成分的检测，尤其涉及鹌鹑源性成分的检测。

背景技术：

疯牛病、禽流感、羊搔痒病在世界各地的蔓延和传染给人类的事例，引起了各国政府和消费者对肉食品、饲料安全性的高度关注。目前畜禽肉食品的动物源性成分的鉴别检测已涉及到肉食品的工业、进出口贸易、市场及餐饮业等领域。同时，国内外肉食品及饲料贸易市场中的检验检疫工作对高新技术的需求也越来越迫切。因此，研究出一种准确、快速、可靠的鉴别畜禽类动物源性成分的方法，就非常有必要。

目前，为了确定食物及饲料的真实成分，已经开发了很多对动物源性成分鉴别的方法，有物理、化学、免疫学和分子生物学等方法。

在分子生物学方法中，分子标记技术以其快速、准确、稳定、高效等优点显示出巨大的开发潜力和广阔的应用前景。目前在动植物源性成分鉴别检测中应用的分子标记主要包括核DNA、RNA、线粒体DNA(mtDNA)、和蛋白质分子标记等。PCR分子标记鉴别检测技术，具有特异性高、针对性强、灵敏度高、简便快速、对检测样品要求低(几乎所有的样本都可以作为PCR的材料，它只要求样本中有完整的靶序列核酸)，因此，无论是经过远途运输或低温保存多年的陈旧样本，都可以用于PCR扩增。

哺乳动物和禽类mtDNA在遗传上相对独立，是双链的超螺旋环状分子，具有基因组小(约16kb)、没有重复序列、生物个体内无组织特异性、每个细胞中含有大量线粒体基因组(哺乳动物约1000～2300个拷贝)等特点。因此，用mtDNA分子标记鉴别畜禽肉食品及饲料动物源性成分与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定易操作等优势。基于动物mtDNA的PCR分子标记技术的上述特点，因此在动物源性成分鉴别检测中的应用具有广阔的前景。

国外已对牛、绵羊、猪、鸡的源性成分进行了研究报道，国内对牛、绵羊、猪、鸡、驴、马、鹿属进行了研究报道。在用分子生物学方法鉴定检测动物源性成分的研究上，国内外尚未见到对鹌鹑源性成分鉴别检测的研究报道。

发明内容：

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种PCR-mtDNA技术检测鹌鹑源性成分的扩增引物及其特异性引物的扩增条件。

本发明的另一目的是提供一种PCR-mtDNA检测鹌鹑源性成分的检测试剂盒。

本发明的还有一个目的是提供一种PCR-mtDNA检测鹌鹑源性成分的检测试剂盒的使用方法。

以解决准确、快速、可靠的用PCR-mtDNA技术鉴别鹌鹑源性成分。

本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现：一种用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其主要特点是上下游长度均为18bp的核苷酸，序列如下：

上游引物AF(18bp)：5，-TGAGCTCAATAGCCGCCA-3′；

下游引物AR(18bp)：5′-TGGCTTAATGGTTGGGTG-3′。

所述的用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，所述的特异性PCR-mtDNA扩增引物的扩增条件为94℃预变性5min，1个循环，然后进入PCR循环：94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸20sec，设计35个循环，最后72℃延伸8min。

所述的用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA检测试剂盒，包括有：①10×PCR缓冲液，其中含Mg²⁺20mmoL/L；②dNTP，其中2.5mmoL/L；③上游引物AF，其中25pmoL/L；④下游引物AR，其中25pmoL/L；⑤Taq酶，其中2U/μL；⑥灭菌超纯水；⑦DNA模板。

所述的用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA检测试剂盒使用方法，包括有如下步骤：

(1)待检物DNA的提取；

(2)试剂盒中各组分与待检物DNA混合，按权利要求2的条件进行PCR扩增；

(3)PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，含有鹌鹑源性成分的检测物被引物AF+AR扩增出DNA限制性片段，阳性即为检测出含有鹌鹑源性成分。

所述的用于鹌鹑源性成分检测的PCR-mtDNA检测的试剂盒使用方法，所述的待检物DNA的提取有如下步骤：

①称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的1.5ml离心管中，加入500μl细胞裂解液消化；