[发明专利]创伤血清对炎性细胞NF－κB的激活作用检测及其用途

权利要求书

1.一种试剂盒，含有pNF-κB-LUC质粒，Lipofectamine2000转染试剂，细胞培养裂解试剂，荧光素酶分析试剂。

2.权利要求1的试剂盒在检测创伤血清对炎性细胞NF-κB的激活度数值中的应用。

3.根据权利要求2的应用，其中所述的炎性细胞，是指单核/巨噬细胞、多型核白细胞、淋巴细胞、内皮细胞等细胞株或上述各类细胞的原代细胞。

4.根据权利要求2的应用，其中所述的炎性细胞是离体培养的炎性细胞。

5.根据权利要求2的应用，其中的激活度数值能够判定早期严重创伤患者炎症反应状态。

6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述分析，是将正常血清组与创伤血清组对NF-κB的激活度数值进行比较。

7.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述比较，是将正常血清组与创伤血清组对NF-κB的激活度数值进行比较，与正常血清组相比，创伤血清组对NF-κB的激活度数值明显增大，与正常血清组相比，MODS组、死亡组中所述增大分别较非MODS组、存活组更为明显。

8.权利要求5的应用，是用在创伤患者器官功能炎性损害及死亡结局的判定中。

9.权利要求8的应用，其中所述创伤患者器官功能炎性损害是指创伤患者脑、心、肺、肝、肾、胃肠功能的继发性炎性损害。

10.一种创伤血清对炎性细胞NF-κB的激活度数值的检测方法，其特征在于，用权利要求1的试剂盒中的试剂进行检测，检测方法包括以下步骤：

1)、细胞培养：将炎性细胞接种于96孔细胞培养板，调整细胞数为0.7×10⁵/孔，分为炎性细胞组、炎性细胞+0.48μg pNF-κB-LUC组、炎性细胞+0.48μgpNF-κB-LUC+10％正常血清组、炎性细胞+0.48μg pNF-κB-LUC+10％创伤血清组；

2)、质粒转染：将0.48μgpNF-κB-LUC质粒加入50μl无血清无抗生素的1640培养基中，混匀；  将1.2μl Lipofectamine2000转染试剂加入50μl无血清无抗生素的1640培养基中，在室温下混匀，放置5min；将二者在室温下混匀，放置20min；加入到上述相应细胞培养孔中，培养24h；

3)、加入血清：离心培养板，将各孔中的液体吸出，用D-Hanks液洗细胞1次，于上述相应细胞培养孔加入正常/创伤血清20μl，并补加RPMI-1640完全培养基至200μl/孔，使血清终浓度为10％，培养细胞6h；

4)、裂解细胞：离心培养板，将各孔中的液体吸出，用PBS洗细胞1次，于上述各孔加入细胞培养裂解试剂100μl，作用10min；吸出液体至0.5mlEp管中，冰浴、旋涡振荡1min，室温12000r.p.m离心2min；小心吸取上清，直接检测或放入-70℃冰箱保存；

5)、荧光素酶活性检测：放好检测板，每孔加入100μl上清，再加入100μl荧光素酶分析试剂，于免疫发光检测仪上立刻读数，打印或记录数据。