[发明专利]一种筛选自身抗原的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学和蛋白质领域，具体而言涉及一种快速筛选自身抗原的方 法。本发明的方法可以在几个月内从细胞提取的蛋白中有效地筛选出自身抗原，而适合为 自身免疫病、肿瘤等各种能够产生自身抗体的疾病的药物制备提供有用的靶标。

背景技术

生物、物理、化学以及药物等因素作用于机体时，可以使自身抗原发生改变、免疫 隔离部位抗原释放、分子模拟效应产生、表位扩展以及免疫忽视被打破，这些改变可以引起 自身免疫病。二十世纪七十年代发现肿瘤患者体内可以检测到自身抗体和(或)自身反应性 T淋巴细胞，证实了肿瘤抗原(自身抗原的一种)的存在^[1]。目前认为肿瘤抗原产生的分子机 制主要包括细胞癌变过程中合成了新的蛋白分子，基因突变或重排使正常蛋白分子结构发 生改变，糖基化等原因导致异常的细胞蛋白特殊的降解产物，隐蔽抗原表位的暴露，胚胎抗 原或分化抗原的异常表达等。

自身抗原的鉴定对研究自身免疫病，肿瘤疾病的发病机理，机体的免疫功能与疾 病发生发展和转归的相互关系至关重要；是发展有效的疫苗，诊断试剂，治疗性抗体，筛选 有效药物靶点的必要前提。因此自身抗原鉴定的新方法不断出现，根据研究目的不同大致 可以分为两大类^[2]，一是以探索新型抗原或抗体为目的方法；二是以评价被报道过的抗原 或重要功能蛋白为目的方法。第一类抗原鉴定的方法应用比较多的主要有两种，基于cDNA 表达文库筛选的血清学分析方法(serologicalanalysisofrecombinantcDNA expressionlibraries，SEREX)和基于二维凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis， 2-DE)、Western-blot的血清学蛋白质组分析方法(Serologicalproteomeanalysis， SERPA)。第二大类方法包括常规免疫检测方法和应用肽序列标签研究抗原的方法，前者包 括酶联免疫吸附测定(enzyme-labeledimmunosorbentassay，ELISA)和蛋白芯片法。

第一大类方法立足于发现新型的自身抗原。cDNA表达文库筛选的血清学分析方法 是目前文献报道比较多的方法，该方法的主要优点是通量高，应用多个抗原特异的血清在 一次实验中可以检测多个肿瘤相关抗原。用SEREX方法虽然已经鉴定多种肿瘤相关的抗 原^[3-9]，但该技术的主要缺点比较明显^[6]：1.免疫筛选的原核表达系统不能对外源表达蛋白 进行糖基化修饰，不能保证重组蛋白的正确折叠，因此体液免疫反应不能检测相应抗原的 特定表位甚至所有表位；2.cDNA文库的建立对高表达水平的抗原有偏好，而相应的低丰度 抗原可能被漏掉；3抗原鉴定需要的时间相当长，工作量很大。SERPA技术是2000年出现的鉴 定自身抗原的一种方法，该方法以2-DE和Western-blot为基础，联合蛋白质谱鉴定策略筛 选自身抗原^[10]。与SEREX方法比较，该方法主要的优点是整个实验耗时较短，避免了构建 cDNA文库和预杂交消除非特异性结合的步骤，可以保持蛋白的转录后修饰，更好地提供抗 原决定簇。

SERPA技术用于自身抗原的筛选研究虽然已有众多报道^[10-21]，但其主要的不足是 2-DE本身的一些缺陷如分离极酸、极碱蛋白和水溶性差的膜蛋白能力有限，检测灵敏度的 限制只能鉴定丰度相对较高的抗原，另外2-DE是劳动密集型实验，检测的血清越多工作量 越大。同时，所需患者或对照血清量较大。第二大类方法是对现有的抗原进行评价，而不是 探索新型自身抗原的方法。