[发明专利]一种建立抗帕金森病动物模型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学中神经病学、老年医学及转基因技术领域。更具体地，涉及一种抗帕金森病小鼠模型，建立该抗帕金森病小鼠模型的方法，以及该抗帕金森病小鼠模型的用途。

背景技术

帕金森病是一种慢性的中枢神经系统退行性疾病，其发病率随年龄的增加而升高，随着我国人口老龄化进程的发展，帕金森病病人的人数逐年增多。目前，帕金森病的确切致病原因尚不清楚，普遍的观点认为其病因有环境因素，也有遗传因素，或是由两者共同引发(Vila M and Przedborski S.Nature Medicine 2004，10Suppl：S58-62)。已知的帕金森病相关基因有：α-synuclein、parkin、synphilin-1、UCH-L1、presenilin、DJ-1、PINK1、LRRK2、NR4A2等。帕金森病表现为多巴胺能神经元的进行性丢失，该疾病有一个显著的病理标志，即神经元细胞内的Lewy小体，小体有多种蛋白组成，α-synuclein，parkin，synphilin-1，UCH-L1是其主要成分。在正常神经细胞内，错误折叠，功能异常的蛋白通常被泛素化，再经蛋白降解系统被清除掉。而在患帕金森病病人的神经细胞内，错误折叠，功能异常的蛋白不能被蛋白降解系统清除，而是形成沉积物，最终导致神经细胞的凋亡。

Parkin是一种E3泛素蛋白连接酶，也是泛素蛋白降解系统中重要的一环。它可以将E2泛素结合酶上的泛素转移到其底物蛋白上，从而导致底物蛋白的降解。目前已经发现的Parkin的底物有：α-Synuclein、CDCrel-1/CDCrel-2(cell divisioncontrol-related protein 1/2，属于GTPase家族，与递质释放相关)、Synphilin-1(功能不详)、Pael-R(Parkin-associated endothelin receptor-like receptor，一种推测的G-蛋白偶联受体)、Tubulin、Synaptotagmin XI(一种钙离子结合蛋白)、P38(氨酰-tRNA合成酶复合体的一种组分)和cyclin E(A.Wood-Kaczmar，S.Gandhi andN.W.Wood.TRENDS in Molecular Medicine 2006，12(11)：521-528)。Parkin可以调节细胞生长、细胞凋亡，并在突触传递中发挥作用。新近发现Parkin能够抑制单胺氧化酶的表达；促进线粒体的生物再生，而这些功能同Parkin的E3连接酶作用无关。

小鼠Parkin蛋白由465个氨基酸残基构成，包括C端的两个Ring结构域(负责与E2酶作用)。它是一种广泛表达的蛋白，如在脑、肾脏、睾丸中都有表达，但其在脑内的表达最强，黑质、纹状体、皮层和海马为高表达区域。

对帕金森病人人群的基因分析表明，Parkin蛋白的突变与帕金森病有直接的相关性。一向来至欧洲的调查显示，早发性PD(45岁前)病人中，50％家族性的和18％散发性的PD与Parkin的突变相关。已有研究发现Parkin蛋白可以保护多巴胺能神经细胞免受镁离子对它们的损伤，还可以减少多巴胺诱导的神经细胞的凋亡(Houbo Jiang，YongRen，Jinghui Zhao and Jian Feng.Human Molecular Genetics，2004，13(16)：1745-1754)。

发明内容

本发明的目的就是提供一种抗帕金森病的小鼠模型以及建立该抗帕金森病小鼠模型的方法。

本发明的进一步目的是提供该抗帕金森病模型的用途。

本发明在现有技术科学实验的基础上，提供一种抗帕金森病的小鼠模型。所述的在神经元细胞内过表达Parkin的转基因小鼠对诱发帕金森病的神经毒素具有一定的抵抗作用。该类模型还能成为筛选治疗帕金森病的基因靶点的工具。

在本发明的第一方面，提供了一种产生抗帕金森病小鼠模型的方法，包括步骤：

(i)提供一线性化的转基因构建物，该构建物从5’至3’依次含有(a)大鼠烯醇化化酶的启动子，(b)-globin基因的一部分和Parkin-Flag或Parkin-Flag，(c)人生长激素小基因或SV40多腺苷酸加尾信号；

(ii)用显微技术将步骤(i)中的线性化的构建物基因引入C57/BL6x CBA子一代小鼠或C57/BL6小鼠受精卵；

(iii)将步骤(ii)的受精卵移植到假孕的远交系ICR小鼠的输卵管；