[发明专利]一种培育高含量甜叶菊糖苷遗传材料的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种培育高含量甜叶菊糖苷遗传材料的方法。

背景技术

蔗糖等可以被正常人摄取、吸收、转化。过量的蔗糖导致糖尿病患者血糖上升，引起糖尿病并发症，甚至危及到生命安全。

目前糖尿病患者的数量呈逐年增加的趋势，另外正常人过量摄取可吸收性糖也不利于身体健康，为此具有与蔗糖口感相近，同时为非吸收性、无能量代谢的甜味剂--天然糖的开发利用就成为今后的发展方向。甜叶菊糖苷在人体内基本上以原体排出，不会分解而产生葡萄糖，是一种极低热量的甜味剂。随着人们生活水平的不断提高，越来越倾向于使用天然植物无能量甜味剂是势在必行。在世界上许可添加的几大类甜味剂中，一半来自化工合成，如：糖精、甜蜜素等；另一半来自于天然植物，如：蔗糖、罗汉果糖苷等。

在天然植物无能量甜味剂中甜度比较高的就有甜叶菊植物，其糖作为甜味剂应用也是近十几年的事，而且应用范围越来越广泛。由于其甜度高、无能量等特性而被广泛地应用于食品、保健品、药品、化妆品、抗氧化食品、饲料添加剂等行业。

甜叶菊植物中有几种甜味成分，但主要含量是蔗糖甜度300倍的St(英文：Stevioside)和450倍的RA(英文：Rebaudioside A，或称为甜叶菊A₃，英文：Stevioside A₃)。获得高含量甜叶菊糖苷的品种，就可以降低工业化加工生产成本，提高收率，增加效益。

发明内容

本发明的目的就是提供一种培育高含量甜叶菊糖苷遗传材料的方法，即利用本发明创建一个甜叶菊糖苷高含量的种质资源品系。

本发明具体步骤为：

(1)根据“节数平均24节，叶片大、茎杆粗壮、生长迅速、适应性强”的原则对单株植株进行初步筛选；

(2)将初选植株的叶片使用直径0.5～1.5cm打孔器打孔，避开叶片的主脉打取1～10片，重量0.5±0.005克；将叶片破碎后，采用下列测定糖苷的试剂组成进行一般性测定。将200g酒石酸钾钠，10～30g氢氧化钠溶于0.8L蒸馏水中；搅拌加热下，将3，5-二硝基水杨酸3～9g、结晶酚3～9g、亚硫酸钠3～9g，先后于溶液中溶解；最后再加入铁氰化钾0.1～0.5g使其溶解，冷却后加蒸馏水定容至1L所得到的溶液；

在上述的一般性测定数据结果中优选出优良单株，优良单株占单株的0.1％～10％，利用高效液相色谱仪对优良单株叶片中的甜叶菊糖苷做进一步分析；

(3)初步获得几个甜叶菊糖苷含量较高的优良植株，以这些植株为材料进行组织培养扩繁，甜叶菊再生体系的外植体为无菌苗的茎尖，培养基如下：

愈伤组织形成的培养基：MS+6-BA 0.6mg/L+NAA 0.25mg/L；

不定芽分化的培养基：MS+6-BA 1mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L；

不定芽继代培养基：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L；

不定芽生根培养基1/4MS+IBA 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L；

MS：植物组织培养中常用的完全营养培养基，6-BA：6苄基嘌呤；NAA：萘乙酸；IBA：丁基嘌呤；

(4)将组培苗移植到大田种植，经高效液相色谱仪检测进一步分析；

(5)将所得的品系自交，经过遗传方法分析，获得纯合体植株。

本方法的开发原理：针对甜叶菊糖苷含量进行。分三次实施：组织培养前、组织培养后以及收获第一代种子。如下：

由于甜叶菊是异花授粉，长期以来严重退化，群体的形态、糖苷含量、生长速度等明显杂合。我们以糖苷含量6～11％的甜叶菊植物活体为材料，采用下列测定糖苷的试剂组成进行一般性含量测定。通过测定获得高糖苷含量的植株；再通过组织培养，获得群体，高效液相色谱仪检测进一步检验糖苷含量，自交获得纯合体植株，收获种子。

从该材料群体中测定植株的相同叶位做第一次单株选育，选出糖苷含量高的单株进行组织培养。将组组织培养苗移栽定植到大田后再进行定株定叶位测定糖苷含量，测定方法同前，作为第二次单株选育。再进一步选出糖苷含量高的单株进行扦插、无性繁殖；成株后进行第三次单株选育，测定方法同前。干叶总糖苷含量大于13％±2％，通过有性繁殖收获种子，这是组织培养后的第一代种子，从而得到甜叶菊新种质资源品系。该甜叶菊种质资源品系是生产高糖苷含量的原料，糖苷含量从6～11％提高到13％±2％。

本发明的方法可以应用如下：