[发明专利]环介导等温扩增－微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌的方法

权利要求书

1.一种环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：以上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物在内的环介导等温扩增反应得到扩增反应物--待测猪链球菌种属特异性基因的双链目标序列，将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在微孔板上进行固定，然后将纳米硫化镉对来源于猪链球菌种属特异性基因的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与固定在微孔板上的目标序列进行分子杂交并进行同位镀汞阳极溶出伏安法的电化学测定。

2、如权利要求1所述的环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌的方法，其特征在于上述的两对引物为：

上游内引物：5’-TGATCTTTCTTGTCACCTGTTCCATCTGTCCGTATGGATGTTC-3’、

下游内引物：5’-ACGTTGGTAAGGAAACCAAGGATGATTTCAACAACAGCTTCT-3’、

上游外引物：5’-CGTGCGCTTAAATTCTATGC-3’、

下游外引物：5’-GAGAAATTCCTTCACCGTAC-3’。

3.如权利要求1所述的环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌的方法，其特征在于上述的环介导等温扩增反应液中的试剂包括：

(1)10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；1U/μL UNG酶；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；

(2)Bst DNA聚合酶：8U/μL

4.如权利要求1所述的环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌的方法，其特征在于上述的环介导等温扩增反应包括下列步骤：

(1)待检样品DNA模板的提取：

提取待检样品DNA作为环介导等温扩增反应的模板，其中提取样品DNA的光密度值OD_260/280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL之内；

(2)进行环介导等温扩增反应：

A.在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入1μL上述待检样品模板DNA，和UNG酶，恒温50℃放置3min后于恒温95℃放置3-5min，立即置于冰上1-3min；

B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶；

C.于恒温60-65℃放置45-90min；

D.将温度调到80-95℃，反应3-5min后中止反应得到环介导等温扩增反应的猪链球菌种属特异性基因的扩增产物的双链目标序列，取出待用。

5.如权利要求1中所述的环介导等温扩增-微孔板杂交纳米电化学检测猪链球菌的方法，其特征是上述的双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在微孔板上进行固定，其步骤如下：

将扩增产物--待测猪链球菌种属特异性基因的双链目标序列在100℃水浴中煮沸10分钟，然后在冰浴中快速冷却得到待测猪链球菌种属特异性基因的单链目标序列，取100μL所得单链目标序列的溶液至微孔板中，37℃孵育过夜，再于60℃干燥箱中0.5-1.5h蒸干，用含有1％吐温20的0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液清洗除去未固定的单链目标序列，即得到固定了单链目标序列的微孔板。