[发明专利]一种桑蚕卵的活体解剖方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种桑蚕卵的解剖方法，具体涉及一种桑蚕卵的活体解剖方法。

背景技术

桑蚕(Bombyx mori L.)在我国已经被人工驯养5700多年，人们已经可以根据生产的需要，调节桑蚕卵的外周环境，随时控制桑蚕的发育或滞育。桑蚕卵从解除滞育到孵化一般需要11-12天的时间，在这段时间里人们每天都要通过传统的方法解剖桑蚕卵，根据卵内胚胎的发育特征，判断胚胎的发育进程，调节外周的环境条件，促进胚胎发育齐一。

传统的桑蚕卵解剖方法是碱法，即将浓度为20％的NaOH或KOH煮沸后，用铜丝网漏勺将桑蚕卵浸入碱液后，至卵面变为赤豆色后取出，经清水漂洗碱液后，放入平面皿中，用胶头吸管冲吸，直到卵壳被冲破后，吸出已经变性的胚胎，放显微镜下观察。由于桑蚕的品种很多，卵壳的厚薄存在差异，在碱液中浸的时间也要求不同。浸的时间过长，整个桑蚕卵包括胚胎都被碱溶解；浸的时间过短，则吸管冲时很难将胚胎冲出。因此，这一技术要求高的操作，一般都由有经验的技术员进行操作。

另外，随着桑蚕发育生物学和分子生物学的研究的飞速发展，近年来，研究胚胎的发生及其分子调控机制已经成为研究热点。目前，还国内没有解剖桑蚕卵活体胚胎的相关报道，在一定程度上制约了活体胚胎的体外培养。抽提桑蚕卵核酸(DNA或RNA)的方法都是连同卵壳一起放入液氮后研磨，卵壳上的附着物中会包含大量的微生物，会影响核酸(DNA或RNA)的抽提效果。

发明内容

本发明目的是提供一种桑蚕卵的活体解剖方法，该方法可以适用于不同厚度卵壳的桑蚕卵，操作方便、经济实用；而且利用该方法得到的胚胎来确定桑蚕卵的发育进程检验快速；并且利用该方法得到的胚胎可以用于活体胚胎的体外培养；另外利用该方法得到的胚胎提取桑蚕卵核酸DNA或者RNA的时候不会有污染。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种桑蚕卵的活体解剖方法，包括下列步骤：

(1)将桑蚕卵放入PBS缓冲液中浸泡后，削开桑蚕卵的一端，挤出桑蚕卵的所有内容物；

(2)在缓冲液中冲洗桑蚕卵的内容物，分离胚胎和卵黄。

上述技术方案中，所述PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)的配方为本领域技术人员已知的现有技术，其中各化合物的浓度为：

NaCl 137mmol/L

KCl 2.7mmol/L

Na₂HPO₄4.3mmol/L

KH₂PO₄1.4mmol/L。

上述技术方案中涉及的解剖器材包括：医用镊子、解剖刀、培养皿、胶头吸管，载玻片。

优选的技术方案包括以下具体步骤：

(1)在超净工作台内，将经72％乙醇消毒5分钟的桑蚕卵放入盛有温度为50℃～55℃无菌PBS缓冲液培养皿中浸泡5～8分钟，采用镊子将蚕卵两边夹紧固定，用解剖刀削开卵的一端，镊子再轻轻挤压，挤出卵内的所有内容物；

(2)用胶头吸管在缓冲液中轻轻冲洗内容物数次，分离胚胎和卵黄分离。

上述技术方案中，桑蚕卵的切口面积占卵面积的10～15％为宜，过大会伤害到胚胎，过小在挤出内容物时，会使胚胎被挤碎。

本方案所得的胚胎可以应用于胚胎发育分析，以确定桑蚕卵的发育进程，具体包括以下步骤：用吸管吸出胚胎至于载玻片上，在400倍显微镜下进行观察，根据胚胎的特征，可确定桑蚕卵的发育进程；如解剖的活体胚胎用于观察发育进程用，则桑蚕卵的活体解剖不需要在超净工作台中操作，解剖器材只需用无菌水清洗即可，

本方案所得的胚胎可以应用于活体培养，具体包括以下步骤：用吸管将完整的胚胎吸入盛有1mL培养基(TC100)培养板中，摇匀后，再将胚胎吸出，植入培养板中即可正常培养；如解剖活体胚胎用于活体培养DNA抽提，所有试剂和器材需要高压灭菌(121℃6.895×10⁴Pa 30分钟)，并在超净台内进行操作；如解剖活体胚胎用于RNA抽提，所有器材需要用焦碳酸二乙酯(DEPC)1‰水浸泡30分钟后，高压灭菌(121℃6.895×10⁴Pa 30分钟)后，180℃灭菌4小时以上，PBS缓冲液(含1‰DEPC)进行灭菌，并在超净台内进行操作。

本方案所得的胚胎还可以应用于分子生物学分析领域，具体包括以下步骤：收集活体胚胎，加入液氮后研磨，按照常规方法可以抽提出核酸(DNA或)RNA，用于分子生物学分析。