[发明专利]磺胺甲噁唑单克隆抗体试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽药残留检测分析技术领域中一种检测磺胺甲噁唑的酶联免疫试剂盒及检测方法。

背景技术

磺胺甲噁唑是应用广泛的磺胺类抗生素之一，它有效地控制了动物疾病，促进动物生长，在降低动物源性病原菌排放改进公共卫生方面，发挥了及其重要的作用，取得了良好的经济效益和社会效益；但长期和大剂量使用，使得磺胺药在体内蓄积，造成药物在人体和动物组织内残留，从而潜在危害人体健康。人体中磺胺药的蓄积会导致磺胺药抗药性的产生，且具有潜在的致癌、致突变性。因此，联合国食品法典委员会(CAC)和许多国家规定，食品和饲料中磺胺甲噁唑等磺胺类物质单个含量均不得超过100μg/kg。

检测磺胺甲噁唑残留量的方法主要有微生物法、仪器检测法、免疫化学法。其中仪器检测法包括荧光光度法、薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GM)、气-质联机法(GC/MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液-质联机法(HPLC/MS)、毛细管电泳法(CE)等，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种检测磺胺甲噁唑的酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的检测磺胺甲噁唑的单克隆抗体试剂盒，包括磺胺甲噁唑特异性单抗、包被的磺胺甲噁唑与载体蛋白偶联物和酶标二抗。

其中，所述磺胺甲噁唑特异性抗体为磺胺甲噁唑单克隆抗体，为优选的磺胺甲噁唑鼠单克隆抗体，该单抗按常规方法制备；所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、血兰蛋白(KLH)等常用载体蛋白，所述磺胺甲噁唑与载体蛋白的偶联物可通过将磺胺甲噁唑和载体蛋白用戊二醛法或重氮化法进行偶联得到；所述标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸钠法交联在二抗上；所述二抗优选为抗鼠或抗兔抗抗体。

为了更为方便现场监控和大量样本筛查，上述试剂盒还包括磺胺甲噁唑标准溶液、显色剂、显色稀释液、浓缩洗涤液、终止液。

所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢，所述B液为四甲基联苯胺(TMB)，所述显色稀释液为醋酸钠溶液；所述浓缩洗涤液为0.05％-1.2％吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述终止液为1-2mol/L的硫酸溶液。

本发明的检测原理为将磺胺甲噁唑与载体蛋白的偶联物做为包被原吸附于固相载体上，加入样品和磺胺甲噁唑单克隆抗体，加入酶标二抗，显色后终止，测样品吸光值，该值与样品中磺胺甲噁唑残留物含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出磺胺甲噁唑的含量，根据酶标板上样品颜色的深浅能得出大致浓度范围。

本发明的检测磺胺甲噁唑的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测动物组织、血清、尿样、牛奶及饲料等样品中磺胺甲噁唑的残留量；对样品前处理要求低、样品前处理过程简单、能同时快速检测大批样品；采用高特异性的磺胺甲噁唑单克隆抗体，主要试剂均以工作液形式提供，检测方法简便易行；具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，将在食品和饲料磺胺甲噁唑残留量的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为检测磺胺甲噁唑的酶联免疫试剂盒的结构示意图

图2为磺胺甲噁唑标准曲线

具体实施方式

实施例1抗原及抗体的制备

1.磺胺甲噁唑-载体蛋白偶联物的制备

(1)参照1999年FrnakeM，etal.报道的方法合成SMZ-HSA全抗原，具体步骤如下：首先取20mg SMZ加到300μl二甲基甲酰胺溶液中，再缓慢加到1ml 0.5mol/LH₂SO₄中，然后在磁力搅拌下将1ml1mol/L NaNO₂缓慢加到SMZ溶液中，反应10min，形成重氮盐。

(2)磁力搅拌下，分别取100mg HSA和100mg OVA各加到4ml磷酸盐缓冲液中。

(3)将上述形成的重氮化盐溶液在磁力搅拌下缓慢加到HSA溶液和OVA溶液中，用1MNaOH将pH维持在8-10，4℃反应1h；

(4)将反应液放在生理盐水中透析3d，每天更换2次生理盐水，以除去未反应的小分子物质及SMZ等。

(5)将橙色的SMZ-HSA和SMZ-OVA溶液分成两部分，一部分于4℃下保存供紫外和液相测试用，另一部分于-20℃下保存。

2.抗磺胺甲噁唑单克隆抗体的制备