[发明专利]检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法及其用途

权利要求书

1.一种核酸检测方法，应用于包括对目标核酸序列进行重测序分析、对已知核酸序列中的突变位点和插入/缺失位点进行检测分析在内的非疾病诊断治疗目的，其中核酸序列中的突变位点和插入/缺失位点差异为单个核苷酸残基，或者为多个核苷酸残基但所述多个核苷酸残基为连续的相同的核苷酸残基；其特征在于其包括以下步骤：

①待测核酸样本的制备；

②检测探针的制备，所述检测探针是由针对各个待测位点的检测探针对P1、P2组成，且所述检测探针对P1、P2分别含有一条核苷酸序列H1、H2,且H1、H2序列和紧邻待测碱基位点两侧的序列互补；检测探针对P1、P2还各含有一条通用寡核苷酸序列H3、H4，H3序列和H4序列的互补序列作为一对通用引物的序列用来对检测探针对进行扩增；且在该检测探针对上至少还含有一个用于与检测芯片上特定位点进行杂交和识别的Tag序列，且该Tag序列位于检测探针P1或P2中间部分，也即H1与H3、或H2与H4的中间部分；

③将各检测探针对与核酸样本退火杂交，在各检测探针对间形成与待测碱基位点处的碱基相对应的缺口；

④将退火后的反应体系均分成A、T、G、C四个反应体系，在A体系中加入dATP，在T体系中加入dTTP，在G体系中加入dGTP，在C体系中加入dCTP，在DNA聚合酶和连接酶的作用下，与待测碱基位点处的碱基互补的碱基就会填充上述缺口，将各检测探针对连接成为一条检测探针；

⑤纯化上述连接的检测探针；

⑥扩增纯化出的检测探针；

⑦通用寡核苷酸芯片的制备，将每张芯片分成A,T,G,C四个杂交区域，每个区域在检测探针对P1、P2间形成与待测碱基位点处的碱基相对应的各个位点上分别点制与对应的检测探针上的Tag序列相同的寡核苷酸序列；

⑧将上述寡核苷酸芯片的A,T,G,C四个杂交区域用来分别和扩增后对应的四个反应体系中的检测探针进行杂交；

⑨对芯片进行结果检测分析。

2.一种核酸检测方法，应用于包括对目标核酸序列进行重测序分析、对已知核酸序列中的突变位点和插入/缺失位点进行检测分析在内的非疾病诊断治疗目的；其特征在于：采用权利要求1所述的核酸检测方法，其中所述的各检测探针对的制备步骤中，还包括另一条检测探针P2’，由探针P1和P2’对插入型模板进行分型检测，由探针P1和P2对缺失型模板进行分型检测；该检测探针P2’含有一条核苷酸序列H1或H2，且H1或H2序列和紧邻待测碱基位点一侧的序列互补；检测探针P2’还含有一条通用寡核苷酸序列H3或H4，H3序列和H4序列的互补序列作为一对通用引物的序列用来对检测探针对进行扩增；检测探针P2’还含有一个用于与检测芯片上特定位点进行杂交和识别的Tag序列及与待测样本插入型多态性位点的插入序列互补的序列H5，且该Tag序列位于H1与H3、或H2与H4的中间部分。

3.根据权利要求1或2所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的待测核酸样本为动植物染色体DNA、目标核酸PCR扩增产物、线粒体DNA、cDNA、细菌或者病毒DNA或RNA。

4.根据权利要求1或2所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的检测探针对中检测探针的不发生连接反应的一端至少还含有生物素标记分子，且该生物素标记分子与检测探针的核苷酸序列之间还含有一段连接臂，有利于后续的检测探针纯化和扩增。

5.根据权利要求4所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的连接臂为碳连接臂、聚乙二醇、polyA或polyT。

6.根据权利要求1或2所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的检测探针的纯化步骤是采用链亲和素包被载体介质来完成的。

7.根据权利要求6所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的载体介质为磁性微粒或聚苯乙烯微球。

8.根据权利要求1或2所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的检测探针的扩增步骤是利用与所述各检测探针对上的通用寡核苷酸序列H3，H4对应的通用引物进行的对称或不对称PCR扩增。

9.根据权利要求8所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的对称PCR扩增，至少在一条通用引物的5’端还含有分子标记；其中所述的不对称PCR扩增，至少有一条为限制性通用引物，另一条为非限制性通用引物，且在非限制性通用引物的5’端至少还含有分子标记。