[发明专利]亚硝酸还原酶的制备及亚硝酸还原酶制剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物酶及酶制剂的制备技术领域，更具体的说，采用发酵技术制备可以降低亚硝酸盐的一种亚硝酸还原酶的制备及亚硝酸还原酶制剂的制备方法。

背景技术

亚硝酸盐作为国家食品卫生法允许使用的食品添加剂，在肉制品加工中被广泛用。它与肌红蛋白反应，生成亚硝基肌红蛋白，呈粉红色，赋予肉制品诱人的色泽，即发色作用；同时可以抑制微生物的繁殖，尤其是抑制肉毒梭状芽抱杆菌的繁殖，此菌可以产生肉毒毒素，引起食物中毒，即防腐作用；还可以使肉制品具有弹性，口感良好，消除原料肉的异味，提高产品品质。但是亚硝酸盐也是公认的致癌物质，对人体有很大的伤害。现在世界各国都在致力于亚硝酸盐替代物以及降低其残留研究。但是至今还未找到一种理想的、能够完全替代亚硝酸盐的物质，世界各国现在都在致力于研究减少肉制品中亚硝酸盐残留量的措施。利用微生物发酵产生的亚硝酸还原酶，可以很好的降解亚硝酸盐，减少其残留，在肉制品加工有很广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种亚硝酸还原酶的制备及亚硝酸还原酶制剂的制备方法。

所述亚硝酸还原酶的制备是采用发酵技术制备的，制备方法包括以下步骤：

(1)将产生亚硝酸盐还原酶的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium MPF-906)干菌粉溶解于生理盐水中，接种于斜面种子培养基，获得种子培养液，其中巨大芽孢杆菌干菌粉∶生理盐水＝1∶2-5(重量比)；

(2)将步骤(1)获得的种子培养液以1-10％的接种量接种于液体发酵培养基中，初始pH为5.0-7.5，在25-40℃、转速100-240r/min下恒温培养20-36h，得到菌悬液；

(3)菌体细胞的收集，将步骤(2)获得的菌悬液摇瓶发酵液在离心率为10000-20000×g、1-4℃冷冻离心10-20min，沉淀菌体用磷酸缓冲液重新悬浮，然后再次离心得到菌体；

(4)菌体细胞的超声波破碎，将提取的菌体细胞，按1000mL培养液菌体细胞加入50-100mM，pH6.5-7.5的100mL磷酸缓冲液(是用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制的，比例是用pH值来控制的，业内人氏都知道)，超声波破碎，超声波条件为180-220w，超声2-10s，间歇9-15s，60-120次，在离心率为26000×g、4℃冷冻离心15min，上清液即为粗酶液；

(5)将粗酶液分离提取，得到亚硝酸还原酶。

所述粗酶液分离提取还包括如下两个步骤：

①硫酸铵分级沉淀：准确量取粗酶液100mL，加入硫酸铵至10-30％饱和度，缓慢搅拌充分混合，4℃下静置2-6h，在离心率为20000-30000×g，4℃下离心10-30min，弃去沉淀，留取上清液；在上清液中继续加入硫酸铵粉末至饱和度50-80％，缓慢搅拌充分混和，4℃下静置过夜，在离心率为20000-30000×g，4℃下离心10-30min后，收集沉淀，溶于50mM，pH6.5的20mL磷酸缓冲液中，于4℃下存放，作透析备用；

②酶液透析及浓缩：将硫酸铵分级沉淀所得酶液于pH6.5-7.5、50-100mM的磷酸缓冲液中透析24-36h，每隔6-8h更换缓冲液一次，透析后，用聚乙二醇粉末浓缩至4000-8000IU/mL。

所述斜面种子培养基为营养肉汤粉1-2wt％，琼脂1.8-2wt％，pH6.5-7.5；或葡萄糖15g，NaNO₂ 1g，K₂HPO₄ 1.35g，KH₂PO₄ 0.7g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，，琼脂20g，定容至1L，调节pH为7，121℃灭菌20min。

所述发酵培养基配方：葡萄糖1-2wt％，蛋白胨0.1wt％，氯化钠0.1-0.5wt％，磷酸氢二钾0.1-0.3wt％，磷酸二氢钾0.05-0.2wt％，MgSO₄·7H₂O 0.02-0.06wt％，MnSO₄·H₂O 0.001-0.003wt％，CaCl₂·2H₂O 0.002-0.004wt％，pH 6.5-7.5。

所述亚硝酸还原酶酶制剂的制备

向浓缩亚硝酸盐还原酶液中添加氯化钠和糖，使其最终质量浓度氯化钠10-20％，蔗糖5-20％，制成亚硝酸盐还原酶液体酶制剂。

所述亚硝酸盐还原酶活性的测定