[发明专利]层粘连蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种层粘连蛋白(LN)生物素-亲和素免疫放大技术结合化学发光免疫分析技术测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

肝纤维化是肝硬化的前期病理阶段，是肝脏受到慢性损伤时，细胞外基质可逆性沉积的创伤愈合过程，许多慢性肝脏疾病均可引起纤维化。目前肝纤维化主要的诊断方法包括影像学诊断、病理诊断和血清学诊断三种。影像学诊断在临床上应用广泛，但只能在肝纤维化晚期发生肝硬化和门脉高压症时才能出现异常图象。而肝纤维化的诊断金指标-肝组织活检，由于所取标本量较少，以及肝脏病变的不均一性，会导致取样误差。鉴于影像学和病理诊断的局限性，人们经过试验和病例研究发现，透明质酸(HA)、IV型胶原(CIV)、III型前胶原肽(PIIIP)和层粘连蛋白(LN)等血清学指标对肝纤维化的诊断有一定价值。并且肝纤维化是一个慢性的渐进性的过程，血清学检测更有利于对组织肝纤维化的动态观察。

正常肝脏间质层粘连蛋白含量较少，但在肝纤维化和肝硬化时，肌成纤维细胞增多，大量合成和分泌胶原、层粘连蛋白等间质成分形成完整的基底膜(肝窦毛细血管化)。层粘连蛋白与纤维化程度和门脉高压正相关，在纤维化后期升高尤为显著，因此可以反映肝纤维化的进展与严重程度。

近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。其中技术工艺成熟，具有先进性且实用性强，易于推广的主要有：放射免疫分析、酶免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和化学发光免疫分析等四种。这些超微量检测技术的基本理论大体相同，但是所用示踪剂及所发出的信号各不相同。根据大量的试验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，依次为：化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。目前层粘连蛋白检测方法主要有放射免疫分析法，酶联免疫吸附层析和时间分辨荧光免疫分析方法等，以酶联免疫吸附层析方法最为普及。放射免疫分析法存在诸多缺点，如操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等，时间分辨荧光免疫分析方法也需要稀有金属进行标记，而采用化学发光免疫分析方法的产品较少。

生物素-亲和素免疫放大技术可极大地提高检测方法的灵敏度，且特异性强，稳定性高，适用范围广，实验成本低。生物素-亲和素免疫放大技术有两种基本类型，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待测反应体系和标记生物素，后在此基础上发展了亲和素-生物素化酶复合物技术；另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测，称为标记亲和素-生物素法。根据待测反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，又分为直接法和间接法。在间接法中，亲和素-生物素系统可以与免疫分析检测体系偶联，放大终反应：先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原(标准抗原和待测抗原)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物，再加入已标记示踪物的亲和素与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大，从而提高了免疫分析的灵敏度。

目前，生物素-亲和素免疫放大技术结合化学发光免疫分析技术在层粘连蛋白免疫分析产品的应用方面比较少见。化学发光免疫分析法结合生物素-亲和素免疫放大技术是一种较先进而有效的方法。利用生物素-亲和素系统间接包被抗体能达到良好的效果，而且更有利于包被抗体与抗原的结合，从而在一定程度上起到信号放大的作用。另外，现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明的试剂盒主要采用微孔板化学发光免疫分析技术，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更易推广应用。

发明内容

本发明同时解决了上述问题，即将生物素-亲和素免疫放大技术结合化学发光技术与层粘连蛋白的免疫分析学有效地结合，提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测层粘连蛋白的试剂盒，该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。

本发明的目的是提供一种生物素-亲和素免疫放大技术结合化学发光免疫分析测定层粘连蛋白的试剂盒及其制备方法。

根据本发明的试剂盒包括：1)层粘连蛋白校准品；2)亲和素化的固相载体；3)生物素化的层粘连蛋白的单克隆抗体和酶标记的层粘连蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体的混合物；4)上述酶所作用的化学发光底物；以及5)浓缩洗涤液