[发明专利]筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒。

背景技术

荷斯坦奶牛是当前世界各国广泛使用的奶牛品种，经高度的选育与良好的饲养管理，生产性能不断提高，在人类生活中发挥着越来越重要的作用。近年来，由于选种选配的不断进行，使奶牛间的近交不断增加，目前世界上大多数荷斯坦牛都可以追溯到北美几头特别优秀的种公牛。在我国，由于大量进口种牛、胚胎和冷冻精液，增加了遗传缺陷快速传播的风险，因此需要逐步建立完善的检测及防控体系。

遗传缺陷指的是由于生殖细胞或受精卵中的遗传物质发生了结构或功能上的改变，从而使发育成的个体出现解剖结构上的异常或生理机能上的损害。遗传缺陷可分为基因突变和染色体畸变两种。而基因突变有异常染色体隐性基因突变居多。目前发现的奶牛遗传缺陷大多属于这类突变。由于隐性遗传缺陷，即杂合型个体虽带有一个异常等位基因，但外表看不出来，因此需要借助分子手段进行检测。如两个亲本都是杂合型个体(Aa)(这里以a表示致病基因，A表示正常基因)，那它们的后代就有1/4的可能出现二个隐性致病基因(aa)纯合的情况，这样的个体通常是致死的，即使是非致死的遗传缺陷，也会大大影响生产性能。杂合型公牛(Aa)虽然只带有一个a，但其却是a基因携带者。这种Aa杂合型公牛常会有健壮外观，女儿牛表现优良，导致a基因在子代、孙代、曾孙代…逐渐传递，经过多代的人工授精，a基因携带者在群体中所占比例就大大提高，从而导致带有二个隐性致病基因(aa)的个体涌现，给奶牛业带来损失。

瓜氨酸血症(Citrullinemia，CN)是荷斯坦奶牛的一种常染色体单基因控制的隐性遗传疾病，最早由澳大利亚科学家Harper报道。随后在新西兰、英国、美国等国家的荷斯坦奶牛中也相继发现。其主要症状为血液中瓜氨酸含量升高，尿素循环受阻引起高氨血症，从而导致犊牛在出生一周内死亡。澳大利亚科学家通过对CN患病犊牛系谱分析发现，几乎所有患病犊牛都可以追溯到一个共同祖先-LinmackKriss King，且该种公牛冻精大量使用，产生很多携带者后代。1989年，澳大利亚某种公牛站中携带者占13％。CN的分子遗传学基础是由位于奶牛第11号染色体(BTA11)上的第5外显子第86和175个氨基酸发生单碱基突变(C→T)所致，该基因编码精氨酸合成酶(Argininosuccinate Synthetase Deficiency，ASS)。ASS参与肝脏的尿素循环，以瓜氨酸和天门冬氨酸为底物合成精氨酸代琥珀酸。第86号氨基酸的点突变形成终止密码子，从而使ASS功能丧失。目前美国、澳大利亚、德国等奶业发达国家已经建立了比较完善的检测及防控体系。由于第86号氨基酸的点突变造成了酶切位点的丧失，因此可以采用PCR-RFLP的方法进行分子检测。其基本过程是：①PCR扩增靶DNA；②用内切酶Eco47I对PCR产物进行酶切。③通过琼脂糖电泳分析结果。在内切酶足量的前提下，若发现DNA条带由两条变成三条，即有一条DNA链未被切开，就可以判定该DNA片段中有碱基突变。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒。

本发明所提供的筛查牛瓜氨酸血症携带者的试剂盒，包括PCR引物和内切酶Eco47I；所述PCR引物为核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2的脱氧核苷酸组成的引物对、核苷酸序列分别为序列表中序列3和序列表中序列4的脱氧核苷酸组成的引物对或者核苷酸序列分别为序列表中序列5和序列表中序列6的脱氧核苷酸组成的引物对。

以荷斯坦奶牛的基因组DNA为模板，用所述核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2的脱氧核苷酸组成的引物对扩增得到自ASS基因外显子的第256位的5′端的第59-340位核苷酸序列(即自GenBank Accession Number NW001492999的5′端第461211位至461492位脱氧核糖核苷酸)；用所述核苷酸序列分别为序列表中序列3和序列表中序列4的脱氧核苷酸组成的引物对扩增得到自ASS因外显子5的第256位的5′端的第175-350位核苷酸序列(即自GenBank Accession NumberNW001492999的5′端第461327位至461502位脱氧核糖核苷酸)；用所述核苷酸序列分别为序列表中序列5和序列表中序列6的脱氧核苷酸组成的引物对扩增得到ASS基因外显子5的第256位脱氧核糖核苷酸的5′端第166-340位核苷酸序列(即自GenBankAccession Number NW001492999的5′端第461318位至461492位脱氧核糖核苷酸)。