[发明专利]鉴定西花蓟马的巢式PCR方法及特异引物

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种能够特异鉴定西花蓟马的巢式PCR方法及特异引物。

技术背景

西花蓟马是一种世界性的危险性害虫，起源于北美洲西部山区，最早记载于1895年，曾是美国加州最常见的一种蓟马，近年来侵入中国部分地区，被国内有关专家确定为危险性外来入侵害虫。西花蓟马直接取食危害，造成蔬菜、花卉及水果等叶片、花器或果面上留下疤痕及斑点。此外，西花蓟马还能传播番茄斑点萎蔫病毒等在内的多种病毒，且在若虫取食植物30分钟后即可获毒，然后主要由成虫传播。目前已知其寄主植物多达500余种，包括重要的菊科、葫芦科、豆科、十字花科等蔬菜作物，尤其是温室种植的花卉、茄果类植物受害最重，因此采取措施防止西花蓟马对植物的危害非常迫切。但由于其卵、若虫、成虫都有很强的隐蔽性，对药剂容易产生抗药性，而常规的防治措施难以奏效，所以在防治及检疫工作中，早期鉴定出西花蓟马并提早防治非常有现实意义。

目前为止，蓟马种类的鉴定主要以雌成虫的形态特征为主，但是西花蓟马的成虫体色具多态性---黑色、褐色和黄色，同时蓟马的若虫、蛹无法通过形态鉴定到种，目前也有对未成熟时期的卵、若虫或蛹进行分类的研究，但仍在研究阶段，尚无明确定论。然而在植物检疫过程当中，发现标本为若虫时，通常须继续饲养至成虫才能够鉴定。这样，不仅耗时，且虫体微小，常常在饲养过程中可能死亡或不明原因消失。因此很有必要开发一种快速、简单且准确的鉴定技术。以PCR技术为基础分子标记技术，能很好地解决这些问题。近年来，利用分子标记技术鉴别昆虫种类的研究非常多，可利用的标记技术也非常多，但由于分析样品的特殊性，对于选择哪种分子标记技术却很重要。在DNA分子标记技术的应用过程中，若所研究的昆虫DNA资料未知的情况下，利用RAPD-PCR技术是最简便、最快速，且需要的DNA量少，可用于各种保存方式的标本，也可做特定害虫的快速鉴定(De Barro P J，Driver F.Use ofRAPD-PCR to distinguish the B biotype from other biotypes of Bemisia tabaci(Gennadius)(Hemiptera：Aleyrodidae).Austrilian Journal of Entomology.1997，36(2)：149-152；Garner K J，Slavicek J M.Identification and characterization of a RAPD-PCR marker for distinguishing Asianand North American gypsy moths.Journal of Insect Molecuar and Biology，1996，5(2)：81-91；Haymer D and McInnis D.Resolution of populations of the Mediterranean fruit fly，Ceratitiscapitata，at the DNA level using random primers for the polymerase chain reaction.Genome 1994，37：244-248)。然而这种鉴定技术的开发需要收集完整的鉴定样品作为对照，否则无法建立完整的分子标记技术；为弥补样品不足的缺陷，直接由已知序列设计引物进行PCR检测目的基因，不失为一有用的方法。根据文献18S和28S rDNA在所有生物中具有功能上和进化上的同源性，其整体结构和核酸序列在物种间非常保守，再加上中间包含保守区和变异区，适合于不同层次上的分类分析(Hillis D M and Dixon M T.Ribosomal DNA：molecular evolution andphylogenetic inference.Quarterly Review of Biology，1991，66，411-453；CruickshankRH.Molecular markers for the phylogenetics of mites and ticks.Systematic and Applied Acarology.2002，7：3-14)。然而在实际的分类鉴定实验中，由于我们得到的标本量少至单头虫体，而蓟马体形微小，单头提取的DNA浓度很低，即使运用上述分子鉴定方法，也经常因为模板量太少而使鉴定工作难以顺利进行。有研究者以线粒体DNA为分析模板，设计出特异鉴定出西花蓟马的特异引物，但由于线粒体DNA在细胞中含量较低，在实际鉴定实验中需要3-4头虫体才能完成鉴定(周力兵，刘忠善，李春艳，丁元明：PCR法鉴定西花蓟马，植物检疫，2007，21(2)：78-81)。