[发明专利]三碘甲腺原氨酸磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，特别涉及到一种定量测定三碘甲腺原氨酸的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒。本发明试剂盒结合了生物素—亲和素免疫放大技术、免疫磁微粒分离技术和化学发光免疫分析技术。

背景技术

甲状腺是内分泌系统中重要的组成部分，是人体内最大的内分泌腺，平均生理重量约为20-25g，甲状腺分泌两种具有生理活性的激素，即甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T₃)。它们在人体生长发育、细胞代谢和体内激素平衡，对维持代谢、骨骼肌和各器官系统的发育都起着重要的调节作用。然而，三碘甲腺原氨酸(T₃)，是不具有明显的生物活性的，血液中3％以下的T₃是由甲状腺分泌的，97％以上都是由甲状腺素(T₄)代谢脱碘而来的，在血液循环中绝大部分与血浆中甲状腺结合球蛋白(TBG)结合。在临床上，检测血液中T₃的含量有助于了解人体的碘代谢及其甲状腺功能状况，另外，血清中T₃的测定不仅可作为诊断甲状腺机能亢进症(甲亢)和甲状腺机能减退症(甲低)的参考指标，而且还有助于低T₃综合症和甲低的鉴别诊断，同时还可以作为观察影响甲状腺激素代谢的药物胺碘酮副作用的一种手段。因此，发明一种快速、高灵敏和高特异性检测人血液中T₃具有一定的价值和深远意义。

目前，免疫分析法作为一种重要的分析方法已广泛应用于临床诊断和生物化学等方面的研究。常用三碘甲腺原氨酸检测的方法有放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)、酶联免疫分析法(enzymelinked immunoassay，ELIA)和时间分辨荧光免疫分析法(time resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)等。这些方法均有着不足之处：放射免疫法不可避免地用到放射性元素¹²⁵I，对人和环境都有一定的影响；酶联免疫分析法有着较低的灵敏度；荧光免疫分析法需要昂贵的仪器和试剂。而化学发光免疫分析法是一种基于化学发光分析的高灵敏度和免疫分析的高特异性的分析方法，该法具有特异性高、灵敏度高、快速、简便及无放射性污染等优点，已受到广大医学、生物和化学工作者的关注。

在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。免疫磁微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲合力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫磁微粒，具有分离速度快、效率高、可重复性好；操作简单；不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。采用免疫磁微粒技术与化学发光免疫分析技术结合检测待测物，可大大提高检测的灵敏度和准确性。该技术的新颖之处有：(1)采用微小的磁微粒作为固相载体，可增加包被表面积，从而增加了抗体的有效包被量，增加了抗原、抗体的接触面积及底物发光面积，提高反应的灵敏度；(2)使用单克隆抗体，提高了反应的特异性。

本发明采用竞争法测定血清中的三碘甲腺原氨酸，通过抗体分别与抗原和酶标抗原或是生物素化的抗原竞争，从而可以迅速的从血清中高度特异的识别相应的抗原。单纯利用物理吸附把单克隆抗体包被到固相载体上会存在抗体用量大，活性损失大等缺点，而采用生物素-亲和素系统(biotin-avidin system，BAS)就可以避免这样的缺点。该系统具有多级的信号放大作用，并且不增加非特异性干扰，且具有灵敏度高、特异性好、稳定性高、适用性强和实验成本低等特点。待测反应体系可以利用生物素化的抗原，使得亲和素-生物素系统与免疫分析检测体系偶联，放大终反应：先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化的抗原与抗原(标准抗原和待测抗原)同时竞争反应，在固相载体表面形成免疫复合物，再加入亲和素与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大，从而提高了免疫分析的灵敏度。本发明就是利用链亲和素标记碱性磷酸酶(ALP)和生物素化的抗原以适当的比例混合，将血清样品和标准加入固相抗体，再加入两种标记物的混合液，链亲和素迅速与生物素结合，生物素化的抗原和ALP标记链亲和素与血清中的蛋白分子竞争形成特异性的结合，然后加入化学发光底物，利用化学发光仪检测相对发光强度，就可以定量分析人血清中的三碘甲腺原氨酸。