[发明专利]一种可调控的肝损伤动物模型的制作方法及其专用载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种可调控的肝损伤动物模型的制作方法及其专用载体。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝炎的主要病原之一，严重危害人类健康。据统计，在世界范围内约有1.7亿慢性感染者。由于缺乏良好的小动物模型，使HCV发病机制的研究还局限于HCV感染自然史的观察和黑猩猩的实验感染，而黑猩猩是受保护动物，在伦理和经济上都受到许多限制，因此人源化小鼠是替代灵长类动物用于HCV感染和药物筛选的理想模型。

近年来，Mercer(Mercer，D.F.et al.Hepatitis C virus replication in micewith chimeric human livers.Nat.Med.7，927-933.2001)、Tateno(Tateno，C.et al.Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolicresponses to drugs.Am.J.Pathol.165，901-912.2004)和Turrini(TurriniP et al.Development of humanized mice for the study of hepatitis C virusinfection.Transplant Proc.2006 May；38(4)：1181-4)等人先后以Alb-uPA小鼠作为移植受体来制备人源化小鼠肝脏，并实现了HCV感染，然而Alb-uPA小鼠uPA基因的表达会造成新生小鼠出血死亡，因此，存在着纯合子死亡率极高以致繁殖后代极为困难的致命缺陷。另外，小鼠肝细胞具有极强的再生能力，Alb-uPA小鼠在出生后1-2个月内，再生的肝细胞替代转基因的肝细胞从而失去适合细胞移植的环境，因此，应用Alb-uPA小鼠作为受体时，移植时间仅限于出生后14天之内，移植手术难度高且移植后成活率低。

最近几年，发展了一些可诱导性表达的表达系统，包括可诱导的真核生物表达系统和原核生物表达系统，但这些系统也存在很大的局限性，表现为：1)以重金属离子、激素及热休克蛋白为诱导剂的真核表达系统，其诱导刺激可引起多元效应，引发许多基因表达，难以区分特异或非特异性事件；在没有诱导剂存在时，还常出现表达泄露现象；2)可诱导性原核表达系统，如基于lac阻遏因子基础上的IPTG诱导表达系统，其作用虽然特异，但其要求的诱导剂剂量接近细胞毒水平，而且诱导过程缓慢、诱导效率低，也难以广泛推广。

近年来发展的一种高效无毒、具有严密开/关功能的基因表达系统，称为Tet-off/Tet-on基因表达系统。Tet-off系统在没有四环素(tetracycline，Tet)或其衍生物强力霉素(doxycycline，Dox)存在的情况下，引起插入启动子下游目的基因的高效表达，随着四环素浓度的增加，基因表达以一种剂量依赖性的方式逐渐关闭直至为零。Tet-on基因表达系统受四环素的作用刚好与Tet-off系统相反，即在没有四环素的情况下表达水平为零，在加入四环素或强力霉素后目的基因高效表达。Tet-off/Tet-on基因表达系统被认为是目前最为理想的真核生物基因表达系统，与目前所用的其他真核基因表达系统比较，该系统具有严密性、特异性、高效性等优点，自推出以来，在许多方面得到了广泛的应用。

Tet-off/Tet-on基因表达系统工作原理如下：

大肠杆菌E.coli株转座子Tnl0中Tet阻遏因子(Tet repressor，Tet R)负性调节四环素抗性操纵子(tetracycline-resistauce operon)，Tet R与四环素有很高的亲和性。在没有四环素存在时，Tet R与Tet操纵因子序列(Tet O)结合而阻断四环素抗性基因的表达；当有四环素时，Tet R对Tet O的阻遏解除，转录启动。