[发明专利]无标记噬菌体展示蛋白质芯片及其制备和检测方法

权利要求书

1.一种无标记噬菌体展示蛋白质芯片，其特征在于：该蛋白质芯片从下而上依次包括玻璃基片、铬膜、金膜、耦联层和噬菌体，所述耦联层为一层HS-(CH₂)₁₀-COOH自组装分子膜，所述的白组装分子膜一端为巯基，以金-硫键与所述金膜共价连接，另一端为羧基，与所述的噬菌体外壳蛋白pVIII上的氨基共价连接；所述的噬菌体为丝状噬菌体，在噬菌体外壳蛋白pIII上展示多肽段或蛋白质，或在噬菌体的外壳蛋白pVIII上展示多肽段或蛋白质。

2.按照权利要求1所述的无标记噬菌体展示蛋白质芯片，其特征在于：所述的铬膜厚度为2～3nm；金膜厚度为40～55nm。

3.按照权利要求1所述的无标记噬菌体展示蛋白质芯片，其特征在于：所述的玻璃基片为6×6～20×20mm²的方片，厚度为0.8～1.2mm，材料采用折射率为1.5～1.8的光学玻璃。

4.一种如权利要求1所述无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

1)先在玻璃基片的一个表面上蒸镀或溅射铬膜，再在铬膜上蒸镀或溅射金膜；

2)将玻璃基片放在1～50mM的巯基十一酸乙醇溶液中浸泡至少24h，形成一层均匀致密的带羧基的自组装分子层，作为耦联层；然后取出基片，清洗并吹干；再将基片金膜一面向下，固定在制备蛋白质芯片的专用装置上；该专用装置由基体(7)、布置在基体内的两个或多个蓄液池以及与每个蓄液池相连的流体通道(703)组成；所述的蓄液池为开口槽，包括检测池(701)和参考池(702)，将蛋白质芯片覆盖在基体(7)上并加以密封；

3)配制含有盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液作为活化剂，其中盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的摩尔浓度为100～200mM，N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为25～50mM，将所述的活化剂注入所述专用装置的参考池和检测池中，持续30～60min，活化蓄液池各自所对应的芯片表面的羧基；

4)通过扩增和滴度调整，配制10¹⁰～10¹¹cfu/mL的噬菌体悬浮液，然后在检测池中缓慢注入所述的悬浮液，持续30min～60min，使噬菌体与芯片表面的活化位点共价结合，噬菌体便固定在检测池对应的芯片表面上，形成芯片的检测区域；

5)配制0.01～0.02％的磷酸盐-吐温20缓冲液，注入所述的检测池(701)，持续5～10min，清洗掉非特异性吸附；

6)在参考池中注入牛血清白蛋白水溶液，使牛血清白蛋白固定在参考池对应的芯片表面上，形成芯片的参考区域，并清洗掉非特异性吸附；

7)在所述的检测池和参考池内均缓慢注入1～2M乙醇胺溶液，封闭对应的芯片表面上残留的活化位点，持续10～15min，再注入磷酸盐-吐温20缓冲液进行清洗，完成无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备；

上述过程都是在室温下进行。

5.按照权利要求4所述的一种无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中在检测池中缓慢注入悬浮液的流速为2μL/min；所述步骤5)中在检测池中注入磷酸盐-吐温20缓冲液的流速、所述步骤6)中在参考池中注入牛血清白蛋白水溶液的流速和所述步骤7)中在检测池和参考池中注入乙醇胺和磷酸盐-吐温20缓冲液的流速均为5～10μL/min。

6.按照权利要求4所述的一种无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备方法，其特征在于：制备芯片的专用装置的基体采用光学玻璃、有机玻璃或PDMS制成。

7.按照权利要求4所述的一种无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备方法，其特征在于：活化剂中盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的摩尔浓度为200mM，N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为50mM。