[发明专利]一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学免疫体外诊断试剂领域，更具体地说，涉及一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术

弓形虫(Toxoplasma gondii)是猫科动物的肠道球虫，由法国学者Nicolle及Manceaux在刚地梳趾鼠(Ctenodactylus gondii)的脾脏单核细胞内发现，虫体呈弓形，故命名为刚地弓形虫。弓形虫病(toxoplasmosis)又称弓形体病，是由弓形虫所引起的一种人畜共患寄生虫病。据文献报道，弓形虫可感染多种哺乳动物，家畜感染率可达10-50％。全球约有10亿人感染了弓形虫，我国人群平均感染率为5.16％。

弓形虫是孕妇宫内感染导致胚胎畸形的五大病原体之一，先天性弓形虫病患者可导致智力发育障碍、神经系统病变如脑瘫、癫痫、脑膜炎、弱智等症状。我国每年约有9万名新生儿受弓形虫病损害，年均耗资上亿元，给社会和家庭带来了沉重的负担，同时也严重地影响了我国的人口素质。

当机体遭受弓形虫感染时，体内会产生相应的抗体(免疫球蛋白，Ig)，来抵抗病原体，以保护机体功能的正常运转。一般规律是先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。IgM抗体滴度在达到高峰后很快开始逐渐下降至较低水平，下降后一般不易检出，而IgG抗体达到高峰后则基本稳定在一个较高的滴度且持续较长时间。临床上检查出弓形虫IgG抗体说明曾经感染过，而且有一定的免疫水平。

弓形虫的病原学诊断方法具有确诊意义，但存在操作较困难、灵敏度低等缺点。因而，血清学试验是目前广泛应用的重要辅助诊断手段。常用的血清学诊断方法主要包括染色试验(Sabin-Feldman DT)、间接血凝试验(IHA)、放射免疫分析(RIA)以及酶联免疫分析(EIA)等。

染色试验存在需要活虫操作的缺点。间接血凝试验虽然与染色试验符合率高但重复性差、致敏红细胞不稳定。放射免疫分析虽然高灵敏、高特异，但存在有效期短、具有放射性污染的缺点。酶联免疫分析虽然有效期长、特异性强，但存在底物大部分有毒或为致癌物质等缺点。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析，是继放射免疫分析和酶免疫分析之后发展起来的一种超高灵敏度的微量测定技术。化学发光免疫分析将抗原与抗体的高特异性免疫反应与高灵敏的化学发光检测技术相结合，具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、无污染、仪器简单经济等优点。它是放射性免疫分析与普通酶免疫分析理想的取代者，是目前最理想的免疫分析方法。

采用酶促增强的化学发光免疫分析原理为:样品中的待测物、酶标记物和固相载体上的包被物特异性结合形成酶标记的抗原-抗体复合物，催化发光底物反应，利用化学反应释放的自由能激发中间体发光，从而检测样品中待测物。

化学发光底物液通常由A、B溶液组成。A溶液含有化学发光剂及增强剂，并加入缓冲溶液配制而成。B溶液由氧化剂和缓冲溶液配制而成。在使用前两者混合，加入到待测溶液中进行反应。

异硫氰酸荧光素(FITC)是一种很稳定的荧光素，极易结合在蛋白分子上，不仅标记简单，而且标记物十分稳定。FITC作为半抗原结合到蛋白质载体上具有很强的免疫原性，FITC单克隆抗体与标记在蛋白质上的FITC反应，不仅特异性高，而且亲和力也高于抗原抗体的结合。

《免疫学杂志》2003年，19(3)期，230-234页《FITC标记单克隆抗体检测icIL-lra的方法研究》公开了通过FITC标记抗体、辣根过氧化物酶标记FITC将其应用于ELISA检测icIL-lra的方法，使用此方法能有效地放大抗原抗体反应敏感性，在免疫分析中有很大应价值。其中，FITC标记单克隆抗体的方法为:将纯化的抗IL-lra单克隆抗体在50mmol/L pH9.5碳酸盐缓冲液透析后，加入DMSO溶解的FITC，4℃反应16小时后经Sephadex-G50纯化后，分装、避光保存。

改良的过碘酸钠法是制备辣根过氧化物酶标记抗体的通用技术，即为在低pH下以NaIO₄先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与抗体上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和抗体结合，99％的抗体与酶结合，酶与抗体的活性无重大损失，是目前最常用的方法。