[发明专利]牛结核病Dot－ELISA快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛结核病的诊断用生物制品，属兽用生物制品领域。

技术背景

牛消耗性传染病。该病一年四季均可发生，呈世界流行性，在流行严 重的地区，感染率可达60％。世界上包括美国、加拿大、澳大利亚等十多 个国家已经实现了无结核牛的报道，但近年来，结核病(bovine tuberculosis) 主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种牛慢性由于野生动 物以及人类结核病的发生与流行，使这些结核病控制良好国家的牛群也处 在不断检疫和高度警惕之中。牛结核不仅导致了养牛业自身生产力的下降， 更重要的是对人类健康构成了严重的威胁。人对牛结核比较敏感，很多病 例与感染动物有接触史。由于牛和人类的关系(牛奶、牛肉及制品等)较其 他动物更为密切，因此约10％左右的人结核病是由牛分枝杆菌引起；有研 究表明，在有结核病奶牛的地区，人的结核感染率可以高达75％。

要从根本上控制牛结核病的发生与流行，首先必须加强对本病的诊断 学的研究，事实上，国内外学者也从未间断过对牛结核病诊断方法的不断 改进。目前对牛结核病的检测，主要有3种方法：结核菌素皮内试验 (tuberculin test，TST)，牛血清ELISA检测法和牛IFN-γELISA检测法。 TST是经典的牛结核病诊断方法，并在世界范围内广泛使用，但该方法暴 露出诸多不足，主要表现在：①高比例的假阳性和假阴性；②不能区分免 疫动物与感染动物；③对检测可疑样品的重复检验需要30天以上；④必须 在活体上进行2次试验，操作繁琐，不利于进行大规模流行病学调查。鉴 于TST存在的缺陷，非常需要一种高度特异性和敏感性的血清学诊断方法 来弥补它的不足，牛血清ELISA检测法因其快速、简便和低成本而备受青 睐。最初人们用PPD作为建立ELISA方法的诊断抗原，但同样存在较强 的非特异性；随着牛分枝杆菌分子生物学研究的深入，包括ESAT6、MPB64、 MPB70、CFP10等大量的分泌蛋白成分在体外获得表达并用作诊断抗原， 建立了间接ELISA诊断方法，这种方法较PPD-ELISA特异性有所提高， 但敏感性却降低了。目前商品化的牛结核菌素IFN-γELISA检测试剂盒只 有澳大利亚Bovigam公司生产的单抗夹心ELISA检测试剂盒。该试剂盒不 仅价格昂贵，而且并不适合我国国情。由于牛结核和禽结核(副结核)之 间存在高度同源，因此用牛PPD(PPDB)刺激外周血细胞时，在被检动物 感染禽结核(副结核)的情况下，同样能产生较高水平的IFN-γ。为了避免 这一问题，Bovigam公司试剂盒巧妙地用禽PPD(PPDA)作为对照，在结 果判定时，用PPDB与PPDA刺激待测样品在ELISA读数中的差值 (OD_PPDB-OD_PPDA＞0.1)作为判定依据。这种方法对没有禽结核(副结核) 或者禽结核(副结核)感染比较轻微的国家比较适用，但由于我国禽结核 (副结核)感染也相当严重，甚至在某种程度上比牛结核更为严重，使用 该试剂盒往往会导致很高比例的假阴性结果。

虽然已有体外表达CFP10和EAST6的研究报道，但目前尚未有人将 该表达产物用作包被抗原吸附到NC膜上，通过Dot-ELISA的方法检测牛 结核病。

本发明的目的是针对上述几种检测方法的不足，提供一种快速、高特 异性和高敏感性的牛结核病检测试剂盒。

发明内容

本发明所涉及技术包括：提取牛结核分支杆菌DNA作为PCR反应的 模板扩增出esxB和esxA基因片段，用基因拼接技术最终扩增出目的基因 (esxB-esxB基因)，将其克隆进质粒中，再转入大肠埃希氏菌，将获得的 含有阳性表达质粒的重组菌按常规方法诱导表达，将表达蛋白经纯化、定 量处理后包被硝酸纤维素膜(NC膜)，用Dot-ELISA方法进行检测。

1牛结核分枝杆菌EAST6和CFP10共表达质粒的构建